复发及难治急性髓细胞白血病病人多药耐药基因检测及意义

时间：2023-03-06 19:20:37 药学毕业论文我要投稿

相关推荐

　　【摘要】目的研究复发及难治急性髓细胞白血病(AML)病人多药耐药基因(mdr1)的表达及其与临床疗效的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测65例AML病人(其中初诊组38例，完全缓解组14例，复发难治组13例)、27例非白血病病人和健康人(包括健康人15例、缺铁性贫血病人10例、特发性血小板减少性紫癜病人2例)mdr1基因的表达水平，并分析其临床意义。结果 AML病人mdr1基因表达阳性率高于对照组，复发难治组mdr1基因表达阳性率高于初诊组和完全缓解组，临床耐药组mdr1基因表达阳性率显著高于非临床耐药组，CR率非临床耐药组显著高于临床耐药组，差异均有显著性(χ2=8.334～49.630，P<0.01)。结论 mdr1基因阳性表达与AML病人临床耐药密切相关，是影响预后的重要因素，可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一。

　　【关键词】白血病髓样多药耐药相关蛋白质类抗药性肿瘤

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expression of multidrug resistance gene (MDRG) and the curative effect in relapse or refractory acute myelogenous leukemia (AML).MethodsA semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to investigate the transcription levels of the human MDRG in 65 AML patients and 27 controls, and analyze the its clinical significance.ResultsMDRG expression was significantly higher in AML patients than in the controls, and higher in relapsed/refractory AML patients than in those newly diagnosed or in complete remission. The gene expression was significantly lower in nonresistant patients than in resistant ones. Complete remission (CR) rate of nonresistant patients was higher than resistant ones (χ2=8.324-49.630，P<0.01).ConclusionMDRG overexpression is significantly associated with clinical multidrug resistance and prognosis, and it is one of the indicators for predicting the prognosis of AML.

　　[KEY WORDS]leukemia, myeloid; multidrug resistanceassociated proteinsmdr1; drug resistance, neoplasm

　　国内外研究证明，多药耐药基因(mdr1)的存在及表达是产生多药耐药(MDR)的主要机制。本文应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测了65例急性髓细胞白血病(AML)病人、27例非白血病病人和健康人的mdr1基因表达水平，分析mdr1基因表达水平与临床耐药的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞系与细胞培养

　　K562/A02由中国医学科学院血液学研究所惠赠，用阿霉素(ADM)诱导K562细胞建立的多药耐药细胞株[1]，具有典型的MDR表型。K562/A02细胞在培养过程中加1 ng/L的阿霉素，使用前3 d撤药。

　　1.2 病人及分组

　　根据白血病诊断标准[2]，选择急性髓细胞白血病(AML)病人65例，男39例(年龄18～63岁)，女26例(年龄22～59岁)，中位年龄34.2岁。其中初诊组(AMLP)38例，完全缓解(CR)组(AMLC)14例，复发难治组(AMLR)13例;M0和M1各1 例，M219例，M315 例，M414 例，M59例，M62例，M71例，杂合型白血病(HAL)3例。对照组27例，其中男16例(年龄19～52岁)，女11例(年龄15～46岁)，中位年龄30.9岁，包括健康人15例、缺铁性贫血病人10例、特发性血小板减少性紫癜病人2例。15例健康人取外周血，余均取骨髓。病人为青岛大学医学院附属医院及聊城市人民医院住院病人。

　　临床耐药诊断标准：①对一线方案诱导治疗2个疗程无效;②第1次缓解后6个月内复发;③第1次缓解后6个月以上复发经诱导治疗无效;④2次或2次以上复发。

　　1.3 半定量RTPCR

　　细胞总RNA的提取：用TRIzol提取细胞总RNA。经MMLV逆转录酶合成cDNA，以逆转录产物加dNTPs、PCR Buffer、mdr1引物进行PCR，取PCR产物定量10 μL 扩增产物，25 g/L琼脂糖凝胶电泳，灌胶前加EB(1 mL 1×TAE 加1 μL EB)，75 V，30～60 min，紫外线灯下观察并照相，用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software及GD1数字化凝胶成像分析仪扫描，计算mdr1基因与βactin的比值。

　　1.4 统计学处理

　　应用医学统计学软件SPSS 12.0处理，结果用±s表示，数据间比较用F检验及χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 AML病人mdr1基因的表达

　　AMLP组、AMLC组、AMLR组和对照组mdr1基因表达值分别为0.78±0.76、0.54±0.45、1.64±1.75、0.20±0.13，AML病人mdr1基因表达值高于对照组，且AMLR组高于AMLP组、AMLC组，差异有显著性(P<0.001)。见图1。

　　图1 mdr1基因表达的RTPCR检测

　　①Marker;②AMLP;③AMLR;④AMLC;⑤AMLM5;⑥Normal;⑦K562/A02;⑧K562

　　根据对照组和AML各组mdr1基因在不同组别的表达，将mdr1/βactin的比值≥1.0定为mdr1基因阳性表达，对照组mdr1与βactin比值均<0.1，根据此标准，AMLR组mdr1基因阳性表达率显著高于AMLP组和AMLC组，差异有显著性(χ2=9.578、8.324，P<0.05)。见表1。表1 各组AML病人mdr1基因阳性表达组别n阳性例数阳性率AML病人临床耐药组mdr1基因阳性表达率显著高于非临床耐药组，差异有显著性(χ2=32.42，P<0.01)，CR率非临床耐药组显著高于临床耐药组，差异有显著性(χ2=49.63，P<0.01)。见表2。

　　表2 AML病人mdr1基因表达与临床耐药的关系组别nmdr1阳性(例)表达率(χ%)CR(例)CR率(χ%)临床耐药251768.0416.0非临床耐药40410.03895.0

　　【论文摘要】《英语课程标准》关于教学中应注意的问题部分指出:“在教学过程中,要始终体现学生的主体地位,教师应充分发挥学生在学习过程中的主动性和积极性,激发学生的学习兴趣,营造宽松、和谐的学习气氛”。

　　【论文关键词】英语教学;课堂;效率

　　教学实践证明,同样的课文,同样的教学内容,同样水平的学生,由于教学方法不同,教学效果往往大不一样。因此,研究如何运用各种教学要素,按照最佳的方式组织教材,提高课堂教学效率,使学生英语教学真正做到“轻负担,低消耗,高效率”具有十分重要意义。

　　在近几年的教学实践中,本人就优化课堂教学过程,做出了一些尝试和探索,现谈一些粗浅的认识和体会。

　　俗话说,良好的开端是成功的一半。头开好了,基础打好了,成功就有望了。对刚开始接触英语的学生来说,当英语教师第一堂课用“English”来陈述一番时,他们觉得挺新鲜,很好奇,好象面对的就是外国人,觉得了不起,此时此刻,那种我也要那样,我一定要学好英语的想法就会油然而生。教师就以次作为入口点,给学生讲述成功人士学好外语的典型例子,激励他们的学习动机,在课堂教学中采取各种各样生动有趣的教学方法和相关手段进一步激发学生浓厚的学习兴趣。

　　1. 通过讲课时的眼神、表情并配合必要的动作来激发

　　在教“cold”一词时,我耸耸肩,搓搓手说“oh,it is.I’m cold”然后我问全班学生“Are you cold?”得到回答是:“Yes,we are。”我又指着挂在窗口大衣,问旁边一位学生,“Is this your coat?Is it yours?”他说“Yes。”接着我用关切的目光告诉他,“put on your coat or you’ll have a cold ”就这样,学生既轻松地学会了单词“cold”,其中又体现了老师对学生的一片关爱之心。其次,采用简笔画。课上教师通过寥寥几笔就能足够勾划出所学内容,学生也会饶有兴趣地学着画起来,对所学印象加深了,就不易忘记。再次,使用图片、实物或自制教具。在教时间时,我自制了一只能拨动的时钟,先是老师问,学生答,再让学生学着边拨钟,边用英语问“What’s the time?/What time is it?”于是,时间的问答及“It is time to…”的巨型也熟练地掌握了。最后,利用对话、游戏。丰富多样的教法能使学生真正做到耳听、眼看、心想、口说、手写,能完善听说读写各种能力,大大地调动了学生的积极性,促使他们乐学,使他们能在轻松愉快的氛围中掌握所学内容。

　　2. 改进教法,进行学法指导

　　着名教育学家叶圣陶先生主张“教是为了不教”,陶行知先生指出,教师的责任是“教学生学”。简而言之,教师在教学中的作用是“指导”两字。教学改革家魏书生教改的核心经验,也是指学生自学。在教学过程中,教师是教育者,是主导,教师的任务是把教学内容传授给学生,在教学过程中做到精讲多练、重点突出、中心明确、言简意明、能解决学生的疑难问题。多讲不仅要保证课堂练习的数量和时间,而且要讲究练的方法,提高练的质量。只有将讲授、阅读、听说和练习有机结合巧妙搭配起来,才有利于使学生对所学的知识做到懂、熟、会,并在课堂上基本解决问题。学生是受教育者,是主体,学生应该成为学习的主人,学生的主动性和学习的质量都有赖于教师的教导,教师要让他们“学会学习”,就必须重视学法指导,指导学生学会预习、听课、记笔记,指导学生独立完成作业、复功课,鼓励学生在课堂上积极思考、大胆发言,培养学生提出问题、发现问题、分析问题和解决问题的能力。

　　3. 分层教学,面向全体学生

　　人与人之间的智力是有差别的,面对不同层次学生组成的群体,要想大面积提高教学质量,关键在于:如何对待学生与学生之间的个体差异,解决好教学要求与学生接受能力不一致这一矛盾。在课堂教学中,首先要面向全体学生,对每类学生的要求要具体、要贴切,做到因材施教。平时备课和上课时,我做到分层次设计教案, 分步实现教学目标和要求,使每个学生在每一节课上都有收获,对基础知识扎实、接受能力强的学生教学时高起点、快节奏、大容量,要求这些学生对有关知识的掌握一步到位;对基础差、分析理解及接受能力较差的学生教学时低起点、慢节奏,小容量、反复练,允许这些学生逐步掌握已学知识,使每个学生都怀有不同程度的喜悦,充分调动全体学生的学习积极性。

　　4. 信息反馈,及时查漏补缺

　　英语与其他学科一样,知识内容由浅入循序渐进、环环相扣、密不可分。这就要求学生平时要有塌实的学风,认真做好预习复习,温故而知新,就象滚雪球一样,经常不断地进行知识积累。教师要有严格的教风,在每一节课,每单元教完后都要进行信息反馈,随时了解学生对以学知识的掌握、遗忘程度,学到一定阶段让学生自己小结,发现问题及时弥补。如在学完了人称代词和物主代词后,让学生总结归纳人称代词的主格、宾格;形容词性的物主代词、名词性的物主代词的形式及其用法,使学生能以正确形式灵活地应用句子中去。在讲词汇的同时,让学生复习回顾同音词、近意词、反义词、一词多意。对前后知识时常进行语法归纳、帮助学生克服遗忘,及时反馈教学信息,使课堂教学更具针对性,有利于学生及时掌握准确的信息,扬弃错误概念,提高学生的综合能力,正确系统地掌握所学知识。

　　多年的实践使我深刻体会到,如果要在教学中树立正确的教学观念改变教学方法,注重学生创新思维能力培养,挖掘学生的创造潜能,教师必须经常更新知识,充实自己,保护学生的好奇心和求知欲,引导学生大胆思考,这样才能使英语课堂的教学效率得到根本的提高。

　　3 讨论

　　白血病细胞对多种化疗药物产生耐药性是造成白血病化疗失败的主要原因，是血液肿瘤治疗亟待解决的问题。关于MDR的形成机制，近来已成为国内外研究的热点之一。近30年的研究发现，多药耐药的机制非常复杂，其中多药耐药基因mdr1编码的P糖蛋白(Pgp)的阳性表达被认为是血液肿瘤耐药产生的主要机制[3]。推测Pgp可能通过3种方式引起MDR：①药物被动扩散入细胞后，在浆膜面与Pgp结合并被泵至细胞外;②基于许多抗癌药物均具有亲脂疏水的特点，认为药物与Pgp在脂质双分子层内结合，未进入肿瘤细胞即被泵出;③进入胞内的药物由Pgp泵入胞质内膜腔，再通过出胞作用排出细胞。 Pgp在人体大多数正常的组织中均低表达，而在MDR细胞中高表达，且Pgp表达的增加与MDR耐药株的耐药程度呈正相关。LOO等[4]的研究表明,Pgp与药物的结合是一种底物诱导契合机制，这种机制决定了Pgp具有能作用于大范围的不同结构化合物的特性。总之，Pgp可对多种化疗药物产生耐药，从而造成化疗失败。因此，检测AML病人mdr1基因的表达对于了解病人的耐药情况，采取逆转耐药与化疗同时进行治疗具有一定的临床意义。

　　本文应用RTPCR检测了65例AML病人和对照组mdr1基因的表达情况，与大多数报道不同的是，我们分组研究了初发、CR和复发难治AML病人 mdr1基因的表达，研究结果显示,AML病人mdr1基因的表达阳性率高于对照组;复发难治组mdr1阳性表达率显著高于初诊组和缓解组，mdr1基因在复发组中表达率高，提示经过长期化疗的筛选，耐药细胞株存活或者经药物诱导产生耐药，是复发组急性白血病诱导缓解率低、预后差的原因。吴少玲等[5]的研究显示,急性白血病病人mdr1表达明显高于对照组，孟繁军等[6]研究也表明复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组。另有研究显示，Pgp阳性白血病细胞内DNR/Rh123的浓度显著低于Pgp阴性细胞，并且细胞内DNR/Rh123的浓度随着样本Pgp阳性率的增加而降低[7]。

　　本实验还探讨了mdr1基因与AML病人临床耐药及疗效的关系，结果显示，AML病人临床耐药与mdr1基因阳性表达密切相关，临床耐药组mdr1阳性表达率显著高于非耐药组;mdr1基因阴性表达组的CR率明显高于mdr1基因阳性表达组，mdr1基因阳性表达严重影响CR率。因此我们推测，mdr1基因阳性表达是判断病人对诱导治疗是否耐药的可靠预测指标，可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一。有研究结果还表明，部分mdr1基因表达阴性的病人也出现了耐药，提示耐药现象的出现不是单一的一种基因或蛋白参与的结果[8]。谭耀红等[9]在分析K562/A02细胞的耐药机制时发现，mdr1 mRNA明显升高，TOPⅡmRNA明显下降，Bcl2表达增高，GST活性增强，端粒酶活性增强，Pgp和sorcin过表达，进一步说明了耐药机制的复杂性。

　　【参考文献】

　　[1]YANG C Z, LUAN F J, XIONG D S, et al. Multidrug resistance in leukemic cell Lane K562/A02 induced by doxorubicin[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995,16(4):333337.

　　[2]BAILLY J D, MULLER C, JAFFREZOU J P, et al. Lack of correlation expression and function of Pglycoprotein in acute leukemia[J]. Leukemia, 1995,9:799807.

　　[3]LEE W P. Purification, cDNA cloning and expression of human sorcin in vincristine resistance HOB1 lymphoma cell lines[J]. Arch Biochem Biophysic, 1996,325(2):217226.

　　[4]LOO T W, BARTLETT M C, CLARK D M. Substrateinduced conformational changes in the transmembrane segments of human Pglycoprotein. Direct evidence for the substrateinduced fit mechanism for drug binding[J]. J Biol Chem, 2003,278:13603 13606.

　　[5]吴少玲,张殿红,贾秀珍. nm232H1基因在急性白血病中表达及与多药耐药关系[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):122125.

　　[6]孟繁军,罗兵,曲彦. 急性白血病多药耐药基因MDR1表达及临床意义[J]. 青岛医学院学报, 1999,35(3):181183.

　　[7]WANG Y H, MOTOJI T, MOTOMURA S, et al. Recovery of drug sensitivity by MS209, a new multidrug resistance reversing agent, on acute myelogenous leukemia blasts and K562 cells resistant to adriamycin cell line[J]. Eur J Haematol, 1997,58:186194.

　　[8]TAN Y H, LI G Y, ZHAO C H, et al. Expression of sorcin predicts poor outcome in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia Research, 2003,27(2):125131.

　　[9]谭耀红,赵春华,杨纯正. 用cDNA Array分析K562/A02细胞多药耐药机制[J]. 中国医学科学院学报, 2001,23(3):272274.

【复发及难治急性髓细胞白血病病人多药耐药基因检测及意义】相关文章：

白血病中MLL重排和HOXa9基因表达05-13

从《滴天髓》看中国传统艺术观08-05

生物技术在食品检测领域中的实践意义08-29

尿路感染患者病原菌的分布及耐药性分析08-27