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响应面法优化耐有机溶剂脂肪酶营养条件
摘要：本文以响应面法对蜡状芽孢杆菌SWWL6 液体发酵产酶的营养条件进行优化。经单因素实验确定发酵产酶的最佳碳源、氮源及无机盐分别为可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4? 7H20 和NaCl。采用部分因子分析法研究初始发酵培养基各种组分对产酶的影响程度，发现酵母膏、NH4NO3 的质量浓度对产酶的影响显著。通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域。中心组合设计和响应面分析法确定最优培养基组成为酵母膏0.64%、NH4NO3 0.384%、可溶性淀粉1%、MgSO4? 7H20 0.1%，NaCl 0.25%，甲苯20%。优化后相对酶活比优化前的提高了3.48 倍。
关键词：耐有机溶剂；脂肪酶；响应面法；蜡状芽孢杆菌
0 引言
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类重要的甘油酯键水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。在特定的非水相系统中，还可催化水解反应的逆反应，以及酯化合成和转酯反应。从催化特性来看，脂肪酶具有化学选择性、高度的立体异构专一性、不需辅酶、高效、反应条件温和、无毒、副产物少等优点。近年来，随着非水相酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了水相中水解反应的范围，被广泛应用于有机相中酯的合成、手性化合物的拆分、高聚物的合成、肽合成、生物柴油的合成等方面，具有广阔的应用前景。有机合成大多数是在有机介质中进行的，而有机溶剂则易引起蛋白质的变性，使酶失活，因此限制了酶在有机合成中的应用[1]。如果一种脂肪酶能在高浓度的有机溶剂中具有稳定性，就能很好的解决催化环境受限的问题，使酶的催化反应更容易化，同时降低了酶的生产成本。
因此耐有机溶剂脂肪酶的研究具有非常重要的意义。目前，关于耐有机溶剂脂肪酶的研究多见于国外报道，日本的Ogino H 等人筛选到有机溶剂耐受菌Psudomonas aeruginosaLST-03[2]。国内鲜见报道，尤其是关于蜡状芽孢杆菌脂肪酶还没有见到报道。
随着计算方法的完善和微机应用的普及，响应面方法已被成功应用于科学研究的许多领域[3、4]。它是一种优化工艺条件的有效方法[5]，采用更为合理的试验设计，能以最经济的方式对试验进行全面研究。该方法已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。本文结合了单因素实验、部分因子实验、响应面法对Bacillus cereus SWWL6 发酵培养基进行了优化，从而提高脂肪酶的产量，为耐有机溶剂脂肪酶的进一步分离纯化、酶学性质及应用研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SWWL6 吉林农业大学生命科学学院生物工程研究室保藏菌株。
1.2 培养基及培养条件斜面培养基：橄榄油0.1%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7.0种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，pH 7.0发酵培养基：橄榄油1%，酵母浸膏0.5%，MgSO4·7H20 0.1%，NaCl 0.25%,甲苯20%，pH 7.0将斜面活化后的菌种接至装有50mL 种子培养基的250mL 三角瓶，30℃，150r/min 培养24h，制得种子液。以5％接种量转接到装有40 mL 发酵液的250 mL 三角瓶中，30℃，150r/min 条件下培养48h。发酵液于8000r／min 离心15min，取上清液测定酶活力[6、7]。
1.3 酶活力测定方法脂肪酶的活力测定采用分光光度计法[8]。在刻度试管中加入1mM p-NPP 溶液lmL 和50mM Tris-HCL 缓冲液(pH8.0)lmL，两者充分混匀后于38℃水浴中保温5min，向测定管加入适当稀释的待测酶液0.1mL，以加热灭活的待测酶液作为空白对照,反应15min 后快速取出，定容至7.5mL 于分光光度计4l0nm 下测定酶催化产生的对硝基苯酚（pNP）的吸光值。脂肪酶 1 个酶活力单位的定义(U)：在上述条件下，每分钟水解p-NPP 产生1μmol 对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
1.4 单因素实验
1.4.1 最适碳源筛选分别以 1%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、橄榄油+葡萄糖（3：2）代替初始发酵培养基的碳源，其他成分不变，配制成不同碳源的产酶培养基，发酵后进行酶活测定。以初始培养基中橄榄油的酶活为100%[10]。
1.4.2 最适氮源筛选以可溶性淀粉作为碳源，0.5%的酵母膏、酵母膏+蛋白胨（3：2）、蛋白胨、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4 七种有机氮源和无机氮源进行最佳氮源的筛选。以初始培养基中酵母膏的酶活作为100%。
1.4.3 最适无机盐的筛选以可溶性淀粉为碳源，酵母膏和NH4NO3 为复合氮源，分别以0.5%的K2HPO4、0.1%的MgSO4·7H20、0.25%和0.5%的NaCl 作为无机盐进行筛选。以K2HPO4 的酶活为100%。
1.5 实验设计
1.5.1 部分因子实验设计(Fractional Factorial Design, FFD)蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SWWL6 菌株产脂肪酶的发酵培养基成分主要有可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯，采用6 因素2 水平的1/8 部分因子实验设计，实验次数为8。拟合出线性方程：
Y = a0 + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X4 + a5X5 + a6X6 (1)式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6 分别为可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯的质量浓度(g/100mL)，Y 为相对酶活力(%)，a0、a1、a2、a3、a4、a5、a6 为方程系数。
1.5.2 最陡爬坡实验设计根据部分因子实验的实验结果,以拟合的一阶模型回归系数的符号和大小来设计显著因素的最陡爬坡方向及步长，通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化, 进行最陡爬坡实验设计，找出峰值, 从而逼近最大响应区域。
1.5.3 中心组合实验设计(Central Composite Design,CCD)[9]
以相对酶活作为响应值，采用2 因素5 水平的中心组合设计对影响SWWL6 发酵产酶的2 个主要影响因素(酵母膏、NH4NO3)进行响应面优化，5 水平的设计,其中中心点取最陡爬坡实验最大响应值时的水平值。
拟合出一个二次多项式方程。该方程为描述响应变量与自变量的经验模型。对于2 因子系统，模型可述为：
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b11X1X1+ b12X1X2 + b22X2X2 （2）式中： X1、X2 为部分因子实验确定对响应值影响显著的2 种培养基组分的质量浓度(g/100mL)，Y 为预测响应值，即相对酶活(%)： b0、b1、b2、b11、b12、b22 为方程系数。用MINITAB 软件对实验进行回归分析，其中回归系数的显著性用t 检验，数学模型方程的显著性用F(Fischer)检验评价，方程的拟合性由确定系数R2 确定。
1.6 模型验证对该多元函数进行简单的性状分析便可确定出其极值点以及取得极值的相应的自变量的取值。再按照计算所得到的参数进行实验，以验证模型的可靠性，并确定最后的优化结果。
2 结果与讨论
2.1 不同碳源对发酵产酶的影响按照 1.4.1 的方法进行碳源筛选，结果如图1 所示：由图 1 可知，在供试的六种碳源中，产生耐有机溶剂脂肪酶相对酶活力依次为可溶性淀粉＞橄榄油+葡萄糖＞橄榄油＞麦芽糖＞葡萄糖＞蔗糖。可溶性淀粉的效果明显优于其它单一组分的碳源，故选可溶性淀粉为发酵最适碳源。
2.2 最佳氮源的选择按照 1.4.2 的方法进行最佳氮源的选择，实验结果如所示：显示的结果明，有机氮源中以酵母膏的产酶效果最佳，无机氮源以NH4NO3 产酶最佳，大多数微生物更倾向利用有机和无机复合氮源，对酵母膏和NH4NO3 组成的复合氮源进行了考察，效果优于单一的无机或有机氮源，因此选用酵母膏和NH4NO3 组成复合氮源。
2.3 无机盐的选择按照 1.4.3 的方法进行无机盐的选择，实验结果如所示：无机盐组分中，0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 对产酶有明显的促进作用，Sharma[11]等报道,往培养基中添加Mg2+有利于大多数微生物产脂肪酶，而大量的Na+对产酶有抑制作用，因此，选用0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 复合物为无机盐。
故确定以可溶性淀粉为碳源，酵母膏和NH4NO3 为复合氮源，0.1%的MgSO4·7H20 和0.25%的NaCl 为无机盐进行下一步的优化。
2.4 部分因子实验筛选液体发酵的显著因素应用部分因子实验对培养基的组成进行筛选，试验设计及实验结果见1。为了统一实验结果，以对初始培养基的相对酶活作为响应值。各因素水平编码值及回归分析见。
R2=99.62%结果显示，培养基成分中对SWWL6 产酶影响较显著是酵母膏、NH4NO3（置信度≥99%）。
且两者对产酶均呈现正效应。该方程的决定系数R 为99.62%明回归方程拟合良好。由显著因子效应可以看出，在原始培养基基础上逐渐增加酵母膏、NH4NO3 的浓度对产酶有有利。
其他因素对产酶影响不显著，维持在低水平。所以选择酵母膏、NH4NO3 这两个因素作为下一步研究对象。
2.5 最陡爬坡实验针对酵母膏、NH4NO3 质量浓度进行最陡爬坡实验。实验设计及实验结果如所示。由结果可知，最大产酶区在第4 次试验附近，故以实验4 的条件为响应面实验因素水平的中心点。
2.6 中心组合设计应用 MINITAB 软件设计中心组合实验，采用22 全因子中心组合实验，共13 次试验。中心组合实验因素水平见4, 2 因素5 水平的响应面中心组合实验设计及实验结果如5所示。
2.6.1 响应面回归模型的建立及置信度分析由 MINITAB 软件拟合得到多项式回归模型为：Y=344.7-24.4X1 -16.5X2-55.5X1*X1-14.2X1*X2-43.1X2*X2 回归方程系数显著性分析如6 所示,模型方差分析见。
R2=98.5%由可知回归方程的一次项、平方项的系数和均方差较大，交互项的系数和均方差较小，说明两个因素间交互效应较小。结果明，在α=0. 0001 水平上，该模型失拟不显著，回归高度显著。决定系数R2 为98.5%，说明模型能解释98.5%脂肪酶产量的变化,回归拟合程度较好。该方法为SWWL6 发酵产耐有机溶剂脂肪酶提供了一个合适的模型，因此可用上述模型代替真实试验点对脂肪酶发酵进行分析和预测。
2.6.2 响应因子水平的优化图 4 绘制了中心组合响应面，以酵母膏和硝酸铵的水平作为平面坐标，以脂肪酶相对酶活作为响应值。
从响应面的立体图可知，回归模型存在最大值，最大值的稳定点是在（-0.2028，-0.1585），对应的X1、X2 实际取值为（0.640，0.384），Y 的最大估计值为348.44。即当酵母膏和NH4NO3的浓度为0.640%和0.384%时，模型预测的最大相对酶活为348.44%此条件下进行重复摇瓶发酵试验，获得实际平均产酶活力为347.98%。预测值与实际值之间的良好拟合性证实该模型的有效性。
3 结论
本文应用部分因子设计和响应面法对Bacillus cereus SWWL6 发酵产酶营养条件进行快速、有效优化。优化后培养基的组成为：淀粉1%，酵母膏0.64%，NH4NO30.384%，MgSO4·7H200.1%，NaCl 0.25%。在优化条件下摇瓶发酵48h 产脂肪酶是优化前的3.48 倍。
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