老年脑标本5羟色胺转运体的表达

老年脑标本5羟色胺转运体的表达

作者：石葛明 王磊　李双成　崔慧先　刘砚星　王伟
【摘要】 目的 观察老年人脑标本5羟色胺转运体的表达。方法 以免疫放射自显影技术显示5羟色胺转运体在人脑标本的分布和强度。结果 5羟色胺转运体免疫反应标记强度在老年组明显降低，中缝背核、尾状核、壳及整个中脑的5羟色胺转运体免疫反应强度比青年组分别降低了16?22%(P＜0?05)、17?64%(P＜0?05)、31?25%(P＜0?05) 和25?58%(P＜0?01)，具有显著差异。结论 老年人脑标本 5羟色胺转运体的低表达表明在衰老过程中5羟色胺转运体随年龄增加而表达减少。
【关键词】 5羟色胺转运体；免疫放射自显影；脑
　5羟色胺转运体（serotonin transporter, SERT）是位于5羟色胺能神经末梢的一种膜蛋白〔1〕，其表达变化直接影响5羟色胺能神经元参与的神经活动。SERT作为常用抗抑郁药物的作用靶点〔2〕，其在老龄后的蛋白表达变化报道较少。目前关于SERT老龄改变的结果多基于SERT配基的放射自显影〔3,4〕及神经显像研究〔5,6〕，因受研究方法和所使用SERT配基特异性不高的限制，研究结果多不一致。本研究拟利用免疫放射自显影技术对老龄人脑标本脑内SERT蛋白的表达进行分析，确定SERT 蛋白表达的老龄改变，以期为今后临床应用正电子发射计算机体层扫描（PET) 及单光子发射计算机体层扫描（SPECT）检测脑内SERT变化，诊断老年相关性疾病提供实验依据。
　　1 对象和方法
　　1?1 对象
　　将死于非中枢神经系统疾病的人脑标本12例分为两组：青年组6例，年龄24～36岁，平均（32?67±4?41）岁；老年组6例，年龄62～75岁，平均（69?67±4?8）岁。
　　
　　1?2　取材
　　脑标本在其死亡后12～22 h自颅内取出。按需要将脑切成厚约5 mm脑块，经10%甲醛浸泡固定（96 h）、常规脱水、透明、石蜡包埋。
　　1?3 免疫放射自显影
　　石蜡块行常规切片（8 μm）、裱片及脱蜡入水；0?01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6?0）抗原修复、0?2% Triton?X?100、8% 正常羊血清预处理（4℃，1 h）；1∶100小鼠单克隆抗SERT抗体孵育（4℃，48 h）；125I标记的羊抗小鼠IgG（1 μCi/ml）室温孵育1 h。125I标记的切片经洗片、风干，与贴有125I?标准、14C?标准的载片置于放射自显影盒内，载片上覆以 Biomax MS 胶片 (REF 832 6886)，曝光10 d（脑干）、14 d（纹状体区）行显影、定影。对照实验不用一抗，其余步骤相同。以固蓝复染上述切片，用于图像分析时的结构辨认。
　　1?4 图像密度分析
　　扫描胶片（300 dpi）以TIFF格式储存,用AIS 软件测量感兴区密度。按Paxinos等编著的人脑图谱, 镜下辨认复染切片的核团，用鼠标勾画相应核团图像边界。以125I?标准校正的 14C?标准dards曲线测量边界内图像密度，计算胶片图像与切片对应核团的125I强度。所得值减去对照组相同核团背景标记值为特异性标记结果（nCi/mg）。相关数据采用t检验。
　　2 结果
　　2?1 SERT标记的一般观察
　　在所观察的脑区中，中脑除大脑脚底和红核以外的大部分区域均含有SERT免疫反应标记信号；端脑的尾状核、壳以及苍白球亦有SERT免疫反应标记信号存在。在这些标记区域中，以中脑中缝背核的SERT标记信号最强。两组无SERT标记信号分布上的差异，但存在SERT标记信号强度的区别，老年组SERT标记强度低于青年组（图1）。
　　2?2 SERT标记的强度分析
　　见表1。除苍白球外，老年组中缝背核、尾状核及壳的SERT免疫反应强度比青年组相同区域分别降低了16?22%、17?64%、31?25%（P＜0?05）；整个中脑水平降低了25?58%(P＜0?01)。所观察的对象中缝背核、尾状核、壳以及中脑每十年分别降低大约3?24%、3?53%、6?25%和5?12%。表1 5羟色胺转运体在老年脑标本不同脑区的标记强度(略)
　3 讨 论
　　位于5羟色胺能神经末梢的膜蛋白SERT〔1〕通过摄取突触间隙的5羟色胺而中止其对突触后神经元的作用，是反映5羟色胺能神经元功能活动的重要指标〔7〕。我们通过对脑内SERT投射源区(中缝背核)和SERT投射靶区（尾状核、壳和中脑等）的免疫放射自显影研究，发现老年组SERT蛋白表达明显低于青年组，表现出随年龄的增加而表达降低，其蛋白表达降低程度相当于每十年减少大约3%～6%。这一研究结果与近年利用SPECT/PET研究在体健康人脑内所观察到的结果基本相符〔5,6〕，即脑干?间脑SERT和配基的结合信号与年龄增加呈负相关(SERT?配基结合信号每十年降低4%～10%)。有研究表明，SERT在脑内的变化与人类的神经精神疾病密切相关〔8,9〕。躁狂病人中脑SERT?〔123I〕β?CIT结合信号明显增加〔9〕，抑郁病人则出现不同脑区SERT?〔123I〕β?CIT结合信号的显著降低〔8〕。有实验证实，随着人类寿命的延长、老龄人口的增加，老年人出现抑郁症状的频率增高〔10，11〕，老年人易患抑郁是否与其较低的SERT蛋白表达有关值得进一步的深入研究。近年分析SERT在脑内变化的年龄关系，主要利用SPECT/ PET〔11,12〕的配基神经显像技术观察活体〔5,6〕以及利用配基放射自显影方法观察人脑标本〔3,4〕的SERT结合位点信号强度的改变，与使用这两种方法的研究相比，我们采用以SERT特异性抗体识别抗原的免疫放射自显影方法，检测的是脑组织内蛋白含量的变化，可真实反映脑内SERT蛋白含量的改变，而前两种方法检测脑内SERT标记信号强度变化的方法属受体与配基的结合，所得结果并非SERT蛋白的表达差异。有研究表明，当脑内SERT结合位点强度（密度）改变时，SERT蛋白含量仍可保持在正常的表达水平〔12〕。另外配基神经显像技术所使用的配基主要是β?CIT，β?CIT除结合SERT外，还能结合脑内DAT，脑内大部分区域都有

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