探讨体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体素在持续黑暗的环境下
1 引言
以前的研究表明，松果体素（melatonin）主要由松果体细胞分泌，它在光照/黑暗（light-dark, L－D）周期下对昼夜节律的调节起着很重要的作用[1, 2]。一般而言，从色氨酸合成松果体素需要一系列的酶促反应。首先，色氨酸从血液循环中被摄取，经过羟化，脱羧，N-乙酰化和氧甲基化，最终形成松果体素。其具体过程如下：色氨酸在色氨酸羟化酶（Tryptophan Hydroxylase, TPH）的作用下羟化为5-羟色氨酸(5-Hydroxytryptophan)。5-羟色氨酸经过芳香氨基酸脱羧酶（Aromatic Amino Acid Decarboxylase）的作用转化为5-羟色胺。5-羟色胺（5-HT）在N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的作用下经过N-乙酰化形成N-乙酰基-5-羟色胺（NAS）。最后通过氧甲基化将N-乙酰基-5-羟色胺（NAS）在羟基吲哚甲基化转移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）的作用下迅速转化为松果体素。合成以后的松果体素并不储存在松果体，而是随即被动地进入血液循环[3]。
光照可以抑制松果体素的分泌，而黑暗则可以促进松果体素的分泌。光照在调节哺乳动物松果体素节律的过程中起着重要的作用。并且，视交叉上核（suprachiasmatic nuclei of thehypothalamus，SCN）是内源性节律产生和调节的主要结构[4]。松果体素节律的产生需要以下几个步骤：眼睛在光照－黑暗（L-D）条件下对光线的感知；视交叉上核（SCN）中 clock基因的诱导作用；交感神经以节律形式传来的神经冲动传到松果体；夜晚去甲肾上腺素(NE)释放的增多。去甲肾上腺素(NE) 和松果体的α-和β-肾上腺素能受体结合，β-受体的兴奋活化腺苷酸环化酶导致细胞内的cAMP 迅速增加[5, 6]。cAMP 作为第二信使，可以调节松果体中N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的活性，最终通过两种方式导致松果体素的合成增加。第一种是通过cAMP 依赖的机制激活N-乙酰基转移酶（NAT）的活性，其中包括mRNA 和蛋白水平的增加；第二种主要是因为cAMP 可以在一定程度上抑制N-乙酰基转移酶（NAT）的失活[7]。N-乙酰基转移酶（NAT）活性的这种节律被认为是松果体素产生节律的主要原因。
有文献报道，体外培养的鸡的松果体细胞分泌的松果体素在持续黑暗的环境下仍然具有节律，并且这种节律在体外维持了几天[8, 9]。鸡的松果体素的这种节律产生系统和其他的哺乳动物的并不一样。鸡松果体素合成的节律由两个oscillators 调节，一个是松果体本身[10,11]，另一个在视交叉上核（SCN）[12]。尽管体内存在两个clocks，松果体中的clock 足以使体外的N-乙酰基转移酶（NAT）活性产生节律。
不管在光照/黑暗（L－D）周期下，还是在黑暗/黑暗（D－D）环境下，体外培养的蜥蜴的松果体细胞都可以节律性的产生松果体素。并且，据报道，体外培养的蜥蜴的松果体细胞产生的松果体素表现出节律性波动，结果暗示了体外培养的蜥蜴的松果体细胞起着circadian oscillator 的作用[13, 14]。近年来的实验结果表明，火鸡的松果体和视网膜松果体素的产生也表现出昼夜节律[15, 16]。他们报道说，在持续黑暗的环境下，火鸡的松果体和视网膜中N-乙酰基转移酶（NAT）的活性和松果体素的水平均具有昼夜节律。然而，他们的实验结果表明，火鸡的松果体和视网膜中羟基吲哚甲基化转移酶（HIOMT）的活性不没有表现出24 小时节律性波动。
本论文采用在持续黑暗的环境下体外培养大鼠的松果体细胞，利用放射免疫分析（RIA）的方法检测大鼠松果体细胞分泌的松果体素水平。目的是为了验证体外培养的大鼠松果体细胞是否具有 circadian clock 可以调节松果体素的节律性产生。Complex cosine function（CCF）统计分析结果表明，新生大鼠的松果体细胞产生松果体素的内源性节律在持续黑暗的环境下可以维持大约9 天。上述结果暗示，它可以作为一个有用的体外模型来分析节律系统的生理基础。
2 材料与方法
2.1 动物和试剂
实验中所用的新生（1 天，SD）大鼠购于安徽省实验动物中心。母鼠在20－23℃和12:12 光照/黑暗周期（7：00 开灯，19：00 关灯）环境中饲养。动物饲养，关爱和应用都遵循相关法律规则，并且尽量减轻动物的疼痛。
细胞培养基 Dubucco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 和胎牛血清（fetal bovineserum, FBS) 购于Gibco 生物公司。缓 冲 液HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 谷氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 链霉素（streptomycin）, 兔抗5－羟色胺（rabbit anti-serotonin）, 胶原酶（collagenase）, 维生素C（Ascorbic acid）购于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin Research RIAkit 购于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany)公司。
2.2 松果体细胞培养
按照以前的文献所描述的方法体外培养原代的大鼠松果体细胞[17]。首先取出生1 天的SD 幼鼠，75％乙醇消毒，无菌条件下取出松果体，放入冷D-PBS 溶液中。后用0．25％胰酶和100u/ml 胶原酶消化液37℃消化，20 分钟后用含10％胎牛血清的培养基中止消化，轻轻吹吸细胞数次，将之打散成单细胞。然后1000 转离心5 分钟，弃上清。细胞沉淀用完全培养基（DMEM, 10%胎牛血清, 55 μg/ml 丙酮酸钠, 2mM 谷氨酰胺（L-glutamine）, 25mMHEPES, 0.1mg/ml 维生素C, 4 mg/ml 葡萄糖, 100 units/ml 青霉素，0.1 mg/L 链霉素）重悬，并按3х105/ml 的密度接种于6 孔板，并于37℃，5％CO2 条件下培养。
2.3 收集细胞培养上清
当大鼠原代松果体细胞数达到106 时，收集细胞培养上清，检测上清中的松果体素水平。为了检测松果体素的昼夜节律，大鼠原代松果体细胞的培养上清在培养3，6，9，12，15天后分别在白天6：00，8：00，10：00，12:00,15:00 和夜晚18：00，20：00，22：00，1：
00，4：00 收集。收集细胞培养上清时注意避光，并且，收集细胞培养上清的时间不超过3分钟。随后，收集的细胞培养上清在4℃12000rpm 离心10 分钟。最后，尽快将细胞培养上清放于－80℃避光保存，以备检测用。
2.4 松果体素放射免疫分析（RIA）
大鼠原代松果体细胞培养上清中的松果体素用放射免疫分析（RIA）法检测，检测步骤按照公司推荐的进行。检测试剂盒中标准品的松果体素水平的检测范围为0pg/ml-1000pg/ml。松果体素检测的标准曲线高度相关，相关系数为0 .999。为了减少误差，每个样本均检测两次。松果体素与N－已酰－5－羟色胺及5－羟色胺的交叉反应分别为0.8%和<0.01%。松果体素检测试剂盒的灵敏度是0.8 pg/ml。
2.5 统计分析
体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体节律用complex cosine function (CCF)分析[18]。曲线的拟合使用非线形回归（nonlinear regression）分析。当p<0.1 时被认为具有显著性差别。
3 结果
在这篇文章中，我们分别收集了体外培养的大鼠松果体细胞在白天 6:00, 8:00, 10:00,12:00 15:00, 和夜晚 18:00, 20:00, 22:00, 1:00, 4:00 各个时间点的培养上清，并用放射免疫方法（RIA）检测了各个时间点松果体细胞培养上清中的松果体素水平。预期值用平均值±标准差来表示。每一组实验数据用下列的公式拟合：Y(x) =M+ A24*cos(x – ф24) + A12*cos (2x– ф12)。在这个公式中，x 代表时间点（in radians）。Y 代表在各个时间点x 松果体素水平的预期值。M 代表平均值。A24 和ф24 分别是 24 小时期间的波幅和相位，而A12 和ф12 分别是12 小时期间的波幅和相位。
在空的加有胎牛血清的完全培养基中发现有极少量的松果体素(数据未显示)。CCF 统计分析结果表明，大鼠松果体细胞分泌的松果体素在完全黑暗的环境下体外培养了3，6，9天后各个参数明显符合CCF（p<0.1），具有昼夜节律。它提示了大鼠松果体细胞松果体素的分泌具有内在节律。但是，这种内在节律在体外培养12 天的时候就消失了。松果体素的波幅第3 天和第6 天的波幅较低，而在第9 天的时候达到最高。但是，体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体素在第3 天，第6 天，第9 天，第12 天的24 小时平均水平依次升高，在第12 天达到最高，而到第15 天又开始降低。
4 讨论
在这篇文章中，我们用体外培养的大鼠松果体细胞来检测松果体细胞分泌的松果体素在完全黑暗（D-D）的环境下是否具有内在节律。有趣的是，我们发现，体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体素具有24 小时节律性波动，并且，这种节律性波动在完全黑暗（D-D）的环境下持续了9 天。这篇文章中的结果和以前的研究结果相一致[19]。不同之处在于他们的实验中用的是松果体组织，而我们用的是体外培养的松果体细胞。他们报道，雄性大鼠在持续黑暗（D-D）的环境下或大鼠致盲的状况下其wheel-running activity 仍然存在。他们发现，雄性大鼠的松果体在locomotor activity 比较高的情况下被摘掉时，其松果体中的松果体素水平要比在活性较低的情况下摘掉时的水平要高，并且，统计结果显示有显著性差异。
以前的实验结果也已经表明，致盲或者持续黑暗的环境（D-D）可以导致山羊或者hamster松果体细胞产生的松果体素昼夜节律的表达[20-22]。
许多实验结果已经表明，鸡的松果体细胞产生的松果体素在光照－黑暗（L－D）环境下甚至在持续黑暗的环境（D-D）仍然表现出昼夜节律[8]。他们用flow-through 培养系统对松果体进行器官培养，发现松果体素的释放具有节律性波动，而且，鸡的松果体素的这种节律性波动在体外培养的条件下至少持续了5 天。在他们的实验中，松果体素的释放在光照－黑暗（L－D）环境下表现出比较明显的节律；然而，在持续黑暗的环境（D-D）中节律的波幅却越来越低。
在这篇文章中，CCF 统计分析结果表明，松果体素的波幅在第9 天的时候达到最高，而第3 天和第6 天的波幅较低。我们推测，松果体素第3 天的内在节律或许是母鼠的遗传特性，而第3 天的内在节律或许是短暂的过渡性的。然而，松果体素真正的内在特性在第9天形成，但是，这种内在特性在体外培养12 天后就消失了。体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体素在持续黑暗的环境（D-D）中表现出的节律性波动明显支持了以下观点，那就是，大鼠的松果体细胞可以作为circadian oscillator 发挥作用。松果体素的这种内在节律在体外持续一段较长时间的重要性有待进一步研究。
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