富勒烯封端的聚谷氨酸苄酯膜的制备及清除自由基能力的测定
引言
富勒及其衍生物在化学、生物医学、材料学及生命科学等领域有许多的重要的应用前景，因而受到许多研究者的青睐。但是由于富勒的笼状结构使其具有其强的亲脂性，这就导致了其在水中的溶解度很小，使它在生物体系中的研究应用受到很多限制。当前，众多研究者都致力于富勒聚合物的合成，这样既可以将富勒的良好化学性质体现出来，而富勒的引入又使得聚合物具有更好的特性，包括机械性和热学性等。迄今为止，富勒聚合物已经成功应用于电致发光装置（electroluminescent devices）、生物活性材料（bioactivematerials）、光学限幅器（optical limiter）、气体分离膜（gas separation membranes）等[1-6]。
目前，有研究者将聚谷氨酸苄酯制备成膜[7]，以研究其生物学效应，但是对于富勒多肽类的成膜制备以及生物学效应研究还没有报道。本章通过铸膜法将富勒封端的聚谷氨酸苄酯制备成膜，并通过邻苯三酚自氧化实验研究其生物学效应。邻苯三酚自氧化实验主要研究以富勒的特征为主的清除自由基能力。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；恒温水浴箱：
北京市医疗设备厂富勒封端的聚谷氨酸苄酯（FPBLG）、聚谷氨酸苄酯（PBLG）均自制FPBLG: 1H NMR（400 MHz,CDCl3），δ：2.2(m,2H), 2.6(d,2H), 3.706(t,2H), 3.739(t,2H),4.24(t,2H), 7.26(m,5H); FTIR(KBr), υmax/cm-1: 696.93, 1520.13, 1625.38, 3033.64, 3290.51;UV-Vis，λ: 229 nm、258 nm、283 nm、418 nm、468 nm、486 nm、494 nm、547 nm、577 nm；MALDI-TOF MS(基质：CCA)：数均分子量Mn=1788,重均分子量Mw=1802，分子量分布PDI=1.007.
PBLG: 1H NMR(400 MHz,CDCl3), δ：2.2(m,2H),2.6(d,2H),3.9(t,H),7.26(m,5H); FTIR(KBr),υmax/cm-1: 696.81, 1541.17, 1663.76(C=O), 2955.86, 3296.86; UV-Vis，λ: 229 nm、258 nm、468nm、556 nm；MALDI-TOF MS(基质：CCA)：数均分子量Mn=5847,重均分子量Mw=6266，分子量分布PDI=1.07.
焦性没食子酸（邻苯三酚）、抗坏血酸（维生素C）、HAc、Tris、EDTA-2Na 均为分析纯
1.2 膜制备
本文采用铸膜法[7]制备膜，分别取0.165g FPBLG 和PBLG 溶于10mL 二氯甲烷中制成16.5%溶液，室温下溶剂挥发成膜，脱模后60℃真空干燥至恒重。
1.3 水溶胀率的测定
将试样在(50±2)℃干燥6 h 恒重称量后，在(25±2)℃ 的恒温去离子水中浸泡不同时间。用滤纸迅速擦干试样表面的水后称量。取 3～5个样品的平均值。吸水率 W=(m2-m1)/m1×100%，式中，m1 和 m2 分别为膜的干、湿质量。
1.4 膜密度的测定
由ρt = aρx/(mt-m0)计算聚谷氨酸苄酯膜的密度，式中，m0 为容器及去离子水的质量和，mt 为薄膜浸入水中后容器及去离子水的质量之和，a 为试样质量，ρx 为水的密度(0.9970g/cm3)，ρt 为聚谷氨酸苄酯膜的密度，其中FPBLG 为2.991 g/cm3，PBLG 的膜密度为1.994g/cm3。
1.5 邻苯三酚自氧化体系检测超氧阴离子自由基[8]
按照， 取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HAc 代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm 比色杯中，在320nm波长处测定光吸收值，每隔15s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值。
1.6 数据处理
本文使用 Excel 统计软件按学生氏t-检验方法进行统计学分析。数据表示平均值±标准偏差，直方图中数据柱代表平均值，上下误差线代表标准偏差。
2 结果与讨论
2.1 水溶胀率的测定
分别测定了 FPBLG 和PBLG 的一周后及两周后的水溶胀率， 从图中可知，一周后的水溶胀率基本为7.9%，变化不大；两周后变化很大，为29.17%，且两种膜的水溶胀率没有太大区别。
从中可以看出，膜的水溶胀率随时间的变化有很大的变化，影响薄膜吸水率的主要因素[9]有薄膜的分子结构（如聚谷氨酸的羟基将会增大薄膜样品的亲水性，提高吸水率）、浸泡时间、温度、表面条件、压力等。
2.2 清除自由基能力的测定
检测了黑暗情况下，不同质量的FPBLG 膜、PBLG 膜以及Vc 对邻苯三酚自氧化速率的影响所示：
通过画出每条曲线的趋势图，并作出斜率，可以由下列公式计算出各种膜的清除速率。
S=(K0-K1)/K0×100%其中K0 代表邻苯三酚的标准自氧化速率，K1 代表加药组的自氧化速率。
据此可测各种膜的清除速率：
S0.025g FPBLG=30.93%；S0.05g FPBLG=72.16%；S0.02g Vc =82.47%从上图可以看出，FPBLG 膜可以减慢邻苯三酚自氧化的速率，对自由基有清除作用，且清除作用随膜量的增加而增加。而PBLG 膜则对自由基基本上没有清除作用。通过测定Vc 清除自由基的能力，与膜清除自由基的能力做了比较，结果发现0.02g 的Vc 清除自由基的能力与0.05g 的富勒封端的聚谷氨酸苄酯的能力相似。
由于要测物质的清除自由基的能力必须将其溶解于水溶液中，已有研究，将富勒聚合物制成纳米颗粒水悬液[10]，从而可以测定其的清除自由基的能力。而对于膜的制备以及生物学效应的研究目前还没有过报道，本文首次测定了富勒聚合物膜的清除自由基的能力。但是也有不足，由于膜的质量较小，所以如若将其沉在比色皿底部，难度较大，本文将其紧贴在比色皿的非透光一端，从而对测定OD 值不产生影响。
3 结论
本文将自制的富勒封端的聚谷氨酸苄酯及聚谷氨酸苄酯分别制备成膜，测定了膜的密度以及水溶胀率，并利用邻苯三酚自氧化体系检测了不同质量的膜在黑暗条件下清除自由基的能力，结果发现FPBLG 的清除效果显著，且随膜量的增加清除自由基的能力明显增强。
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