谈大黄提取物对猪链球菌生物被膜的消除作用论文
大黄是蓼科大黄属多年生草本植物掌叶大黄(R.pal?matum)、唐古特大黄(R.palmatum var.tanguticum)或药用大黄(R.officinale)的根和根茎，其主要有效成分为蒽醌类化合物。蒽醌类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，Ⅱ型猪链球菌为一种常见的病原微生物，它在自然界中分布广泛，可引起人、猪、牛、马、羊和禽等多种动物感染。在人的感染中，猪链球菌常导致化脓性脑炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和眼内炎等疾病，是感染生猪饲养人员和屠宰加工人员的常见细菌。近年来的研究表明Ⅱ型猪链球菌具有形成生物被膜的能力，这会造成疾病感染的持续性和彻底治愈的困难，因此寻找和研究药物对生物被膜的消除作用对疾病的治疗具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
YXQ-LS-50S11 型高压灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);HZQ-F160 全温震荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);无菌净化工作台(苏州苏净集团空气技术有限公司);S-3400N 扫描电镜(日本);电子天平(上海博讯实业有限公司医疗设备厂Sartorius 公司);酶标仪(南京华东电子);超声震荡仪(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);96 孔板(海门市天龙实验器材制造厂);6 孔板(海门市天龙实验器材制造厂)。
1.2 试剂与材料
试剂：THB培养基(中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限公司);结晶紫(天津市风船化学试剂有限公司);冰乙酸(天津市风船化学试剂有限公司);甲醇(天津市风船化学试剂有限公司);乙醇(天津市风船化学试剂有限公司);磷酸氢二钠();磷酸二氢钠()。标准2型猪链球菌菌株ATCC700794，购于美国菌种保藏中心;大黄饮片(掌叶大黄(R.palmatum))，购于同仁堂药店。
1.3 方法
1.3.1 大黄水提物的制备
取大黄100 g ，粉成粗粉，加水1L，浸泡过夜，煎煮1 h，纱布过滤，滤渣加水500 ml 同法煎煮30 min，纱布过滤，合并药液，浓缩，真空干燥，称重，研成细粉，即得。
1.3.2 猪链球菌生物被膜的培养与观察
取猪链球菌菌株ATCC700794 接种于THB 培养基中，37 培养过夜，再用THB培养基稀释菌液浓度为约1.0×106cfu·mL-1，取100μL加入含有无菌盖玻片的6孔板，37 培养72 h，取出盖玻片，灭菌生理盐水冲洗除浮游菌，戊二醛4固定1 h，0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.2)冲洗两次后，乙醇脱水，冷冻干燥。样品表面真空条件下镀一层厚100～150A的金属膜，SEM下观察猪链球菌生物被膜形态。
1.3.3 考察不同浓度大黄提取物对猪链球菌生物被膜的`消除作用
用96 孔板培养猪链球菌生物被膜，并在培养好的96 孔板中分别加入浓度为，31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8 mg/mL和3.9 mg/mL 的大黄水提物，37 培养24 h，无药组为阴性对照组。用移液枪弃去96 孔板中的游离菌，灭菌的PBS(pH 7.2)轻轻洗涤三次，甲醇固定，结晶紫染色，弃去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振荡器10 min，595nm 处酶标仪测定OD 值。
1.3.4 考察大黄提取物的不同加入时间对猪链球菌生物被膜的消除作用
用96 孔板培养猪链球菌生物被膜，并在培养好的96 孔板中加入浓度为7.8 mg/mL 的大黄水提物，37 培养不同时间6 h、12 h 和24 h，无药组为阴性对照组。用移液枪弃去96 孔板中的游离菌，灭菌的PBS(pH 7.2)轻轻洗涤三次，甲醇固定，结晶紫染色，弃去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振荡器10 min，595nm 处酶标仪测定OD 值。
2 结果与分析
2.1 猪链球菌生物被膜的形态观察
使用扫描电镜法观察猪链球菌菌株ATCC700794 培养72 h 后的生物被膜形成状态。观察到大量细菌粘附于无菌盖玻片的表面，且这些细菌被胞外基质如多糖、纤维蛋白、脂蛋白和核酸等物质紧密包裹，形成了具有空间结构的团块状物质，而生物被膜是指细菌被自身所产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细胞形态的结构群落，因此显示的细菌形态表明猪链球菌菌株ATCC700794培养72 h后形成了生物被膜。
2.2 不同浓度大黄提取物对猪链球菌生物被膜的消除影响
利用TCP 法考察了浓度为31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8mg/mL 和3.9 mg/mL 大黄水提物对对猪链球菌生物被膜的消除影响。
2.3 大黄提取物的作用时间对猪链球菌生物被膜消除的影响
利用TCP 法考察了浓度为7.8 mg/mL 的大黄水提物与猪链球菌生物被膜的作用时间对猪链球菌生物被膜的消除影响。
3 讨论
采用了扫描电镜法对猪链球菌菌株ATCC700794 生物被膜的形成进行了形态学的观察，以此判定猪链球菌生物被膜形成最佳培养条件，试验中还对培养12 h、24 h 和48 h时生物被膜的形成情况进行考察，发现培养72 小时生物被膜形成最佳。
采用TCP法测定不同浓度大黄提取物对猪链球菌生物被膜的消除影响，发现生物被膜的消除具有剂量依赖性，当浓度大于7.8 mg/0mL时大黄提取物对猪链球菌生物被膜具有良好的消除作用。同时本研究也对药物的作用时间进行了考察，发现大黄提取物对猪链球菌生物被膜的消除具有时间依赖性，当作用时间大于12 h 时，大黄提取物对猪链球菌生物被膜具有良好的消除效果。以上实验数据为大黄提取物在临床上的使用提供重要实验依据。
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