食品卫生检验中沙门菌属LAMP检测方法的应用效果分析

时间:2020-10-28 10:01:44 生物科学毕业论文 我要投稿

食品卫生检验中沙门菌属LAMP检测方法的应用效果分析

  Loop-mediated isothermal amplification 缩写为LAMP, 环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一门新兴的基因扩增技术,作为一种分子生物学检测技术,具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点,已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。

  摘要:目的:分析沙门菌属LAMP在食品卫生检验中的应用效果。方法:择取2015年2月-11月的食品标本142份,通过LAMP以及分离培养法对其进行检测与鉴定,对比两组检测结果。结果:通过LAMP检测所得结果中,阳性率显著优于分类培养鉴定结果,数据差异存在统计学意义(P<0、05);应用LAMP进行检验,可以通过加荧光染料染色法判断结果;LAMP检测时间不超过24h,而分离培养鉴定时间在4d-7d左右。结论:应用LAMP法对食品进行检测,不仅具有较高的沙门菌属阳性率,而且检测周期较短,实际应用价值显著,值得广泛推广。

  关键词:食品卫生检验 LAMP检测方法 应用效果 沙门菌属

  沙门菌是诱发人体种类细菌性食物中毒的主要因素。现阶段,检测沙门菌的主要方法为分类培养法,该方法虽然具有较好的准确性,但操作程序十分繁琐,免疫学法并不具较好的敏感度,而PCR虽然具有较高的敏感度以及特异度,但在设备方面具有较高的要求,推广限制较大。LAMP属于新兴核酸扩增法,具有特异性强、快速以及简单等优势。本次试验主要通过对比分析分类培养法与LAMP法在食品沙门菌属方面的检测效果,进而探析LAMP法的应用价值。

  一、资料与方法

  1、一般资料

  择取2015年2月-11月的食品标本142份,其中,有6分生食类蔬菜、8份鲜榨果汁、8份沙拉、10份冰激凌、10份生水产品、20份速冻米面、20份非发酵豆制品、20份熟肉、20份生鲜肉以及20份冷冻生肉。以肠炎沙门菌为参考菌株。

  2、检测方法

  取25g食品标本置于无菌均质袋内,以拍击式均质器进行拍打,2min后停止,将其置于37℃环境中培养10h,冷冻食品置于45℃环境中解冻15min。

  对标本行分离培养法检测:在10mlTTB增菌液中接种1ml增菌后标本,然后置于42℃中对其进行培养,时长为24h。另在101mlSC增菌液中接种1ml增菌后标本,在37℃环境中培养4h。各取1杯增菌液,分别进行XLD平板与BS平板接种,于37℃环境中培养24h。择取3个可疑菌落,进行赖氨酸脱羧酶试验培养基、营养琼脂平板以及TSI接种,于37℃环境中培养24h。如果生化反应与沙门菌特征相符,取出营养琼脂平板中的可疑菌落,通过生理盐水,配制为菌悬液,然后通过微生物鉴定系统进行分析。如果XLD平板、BS平板中不存在可疑菌落,继续将BS平板置于37℃环境中培养24h,如检测仍不存在可疑菌落,则为阴性。

  对标本进行LAMP检测:取1ml标本前增菌液,对其进行离心处理,离心率为每分钟10000r,共2min,排除上清提取核酸;另取上清液1l,制成DNA待检模板,对食品标本进行DNA检测,反应后,通过肉眼观察反应液颜色,如果呈现绿色,则为阳性;如果呈棕色,或是无色,则为阴性。

  3、观察指标

  观察两种检测方法的阳性率。

  4、统计学方法

  本次实验过程中,以SPSS19、0统计学软件对两种检测方法所涉及数据进行分析。其中计数的资料用n(%)表示,数据的组间比较以χ2进行检验;计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,数据的.组间比较以T进行检验,P<0、05为统计学差异显著的判定标准。

  二、结果

  LAMP检测方法的阳性率为11、27%,分离培养法的阳性率为4、23%,数据组间比较差异明显,即P<0、05,详情见表1:

  三、讨论

  由各种类型沙门菌引发不同形式的野生禽兽、家畜以及人体感染,被统称为沙门菌病。带菌者,或是感染沙门菌人的粪便会在一定程度上污染食物,导致人体食物中毒。沙门菌极易导致人体发生细菌性食物中毒,主要表现有败血症、肠胃炎以及肠伤寒等,而且具有一定的传染性,可以通过消化道致病。LAMP检测法是新兴恒温核酸扩增法,根据靶基因所具有的6个区域,设计出来4种特异引物,通过特定链对DNA聚合酶进行置换处理,然后将其置于恒温条件下45min左右,促使其产生扩增反应。相对比PCR而言,LAMP在模板方面并不存在紫外观察、电泳、温度循环以及热变性等要求,不仅简单快捷,具有非常强的特异性,而且检测范围相对较大,检测灵敏度较好,在实际应用过程中,不需要借助特定仪器设备,便可以实现现场快捷且高通量检测,成本较低,经济性能显著。

  细菌分离培养法操作程序较为复杂,检测速度比较缓慢,基本上,需要检测7d后,才能获取阳性结果,而且分离细菌后,还要UI器进行增菌与再分离培养,生化鉴定过程中繁琐,且成本较高,难以实现普及。LAMP可以直接提取前增菌液内的核酸,60min中便可以完成对其的扩增操作,沙门菌属检出时间不会超过24h,效率非常高。不仅如此,应用该方法可以通过肉眼直接观察检测结果,具有非常显著的直观价值与便捷性。

  通过本次实验可知,LAMP检测法与分离培养法检测结果的阳性率差异非常显著,LAMP检测阳性率为11、27%,分离培养法检测的阳性率为4、23%,数据比较P<0、05,统计学意义显著。

  四、结语

  应用LAMP法对食品进行检测,不仅具有较高的沙门菌属阳性率,而且检测周期较短,实际应用价值显著,值得广泛推广。

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