探讨不同的胞外基质对ES细胞分化的影响
胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的特性，下面是小编搜集整理的一篇探究不同胞外基质对ES细胞分化影响的论文范文，供大家阅读查看。
胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)在体外可分化为3个胚层的所有细胞[1],定向诱导人ES细胞分化为造血干/祖细胞,可以为造血干细胞移植提供新的细胞来源.目前诱导人ES细胞向造血细胞分化多采用ES细胞与基质细胞共培养以及拟胚体的方法[2,3],但是这两种方法分化效率均比较低,而且存在动物源性污染,离临床应用距离甚远.本研究采用人ES细胞在胞外基质上直接贴壁培养向造血细胞诱导,既没有拟胚体复杂的三维立体结构,又不受基质细胞的影响,从而排除异源性污染,旨在建立人ES细胞分化为造血祖细胞的简单高效的诱导体系,并探讨不同的胞外基质对其分化的影响.
材料和方法
主要材料和试剂
人胚胎干细胞系PKU1.1由北京大学第三医院生殖中心陈贵安教授馈赠,为PKU1连续传代30代后建立的单细胞克隆亚系,染色体核型为46,XX[4].KnockOutTMDMEM培养液、KnockOutTM血清替代品(SR)和IMDM培养液以及胞外基质Fibronectin和CollagenIV均为美国Gibco/Invitrogen公司产品;Matrigel为美国BectonDickson公司产品;细胞因子均为美国PeproTech公司产品;HIT(人血清白蛋白+重组人胰岛素+人转铁蛋白)和甲基纤维素培养液MethoCult4435+为加拿大StemCellTech-nology公司产品;流式抗体均为美国BectonDicksonPharmingen公司产品;MiniRNA提取试剂盒为德国Qiagen公司产品;SYBRGreenSuperMix为美国Bio-Rad公司产品;引物合成由北京奥科公司完成.
胞外基质预处理培养板
设立3组:分别将Matrigel、Fibronectin和CollagenIV置于4℃融化,以预冷的IMDM按1∶20比例稀释.各取2ml均匀铺于6孔培养板,37℃孵育2h,吸出后以IMDM清洗1遍,待用.
人ES细胞直接贴壁培养分步向造血干/祖细胞诱导第1步将生长5-6d后的人ES细胞经Dispase酶消化后,以基础分化培养液(IMDM+HIT+MTG+谷氨酰胺+非必需氨基酸)重悬,按2×104细胞数/cm2的密度接种至胞外基质预先包被过的6孔培养板中贴壁培养,培养液中同时添加细胞因子骨形态发生蛋白(BMP4,25ng/ml)、血管内皮生长因子(VEGF,20ng/ml)和碱性成纤维生长因子(bFGF,10ng/ml)诱导7d;第2步更换细胞因子为干细胞因子(SCF,50ng/ml)、芙莱基3配体(Flt3L,50ng/ml)、白介素3(IL-3,10ng/ml)和白介素6(IL-6,10ng/ml)继续诱导分化7d,共诱导14d.每3d更换新鲜的培养基和细胞因子.在倒置相差显微镜下观察分化细胞的形态.将人ES细胞在未经胞外基质包被的培养板上培养且不添加细胞因子设为对照组.
造血集落形成试验(CFU)
收集培养液中诱导14d的细胞,用PBS清洗2遍,用40μm无菌细胞筛过滤除去大的细胞团块,将分化细胞按1×105细胞数/ml接种于半固体甲基纤维素培养基MethoCult4435+中培养,14d后在显微镜下观察形成的细胞集落数目(CFC).
流式细胞术分析(FCM)
收集培养液中诱导14d的细胞,40μm无菌细胞筛过滤除去大的细胞团块,将细胞密度调整为5×105细胞数/毫升,用PBS清洗3遍,分别加入小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人CD31-PE和小鼠抗人CD45-PE,同型对照为小鼠IgG1-APC和IgG1-PE,4℃避光孵育30min.碘化丙啶(PI)除去死细胞.上机分析分化细胞中各表面标志物阳性细胞的比例.
实时定量PCR检测
分别提取人ES细胞以及诱导3、7和14d分化细胞的总RNA,反转录后采用SYBRGreen法进行实时定量PCR检测造血特异性基因的表达.反应总体系为10μl,反应条件为95℃预变性5min;然后95℃变性10s,退火30s,共40个循环.各基因引物序列及退火温度(Tm)见表1.采用2-ΔΔCt法进行数据处理.
统计学分析实验数据以均数±标准差(珔X±SD)表示,应用SPSS17.0统计软件分析,两组之间进行t检验,3组以上进行单因素方差分析(ANOVA).P<0.05为差异有统计学意义.
结果
人ES细胞和分化细胞形态学观察人ES细胞在无饲养层细胞的培养体系里呈巢状集落样生长,扁平状,细胞之间界限清楚,细胞胞核大,胞质少,核质比高(图1A).当人ES细胞在matrigel、纤维粘连蛋白和IV型胶原蛋白这3种胞外基质分别包被过的培养板里培养,添加造血生长因子开始诱导分化,3组分化细胞镜下形态相似.
随着诱导天数增加,人ES细胞边界逐渐消失,分化出的细胞向四周扩散(图1B),分化至10d细胞表面开始出现许多囊腔结构(图1C),里面充满着圆形细胞(图1D),随着诱导时间的延长,这些圆形细胞有的`会从囊腔结构中跑出来,漂浮在液体里,直至诱导14d时分化细胞的表面布满了圆形细胞(图1E,F).在整个分化过程中,在对照组未出现囊腔结构以及圆形的细胞.
分化细胞的鉴定造血细胞集落形成培养2周后各实验组显微镜下均可观察到红细胞系、粒细胞系和混合细胞集落等各系细胞集落(CFC)的形成(图2B),3组细胞数分别为(10±1.5)×105、(16±3.5)×105及(51±6.1)×105,CollagenIV包被组形成CFC数目明显多于Matrigal和Fibronectin组,具有统计学差异(P<0.01),其中形成CFU-E和CFU-G数目高于Matrigel以及Fibronectin组(P<0.05),形成CFU-GEMM数3组间未见显著差异(P>0.05)(图2A).对照组未见有造血集落的形成.
特异性标志物的表达流式细胞术分析诱导14d的分化细胞,结果显示,Matrigel、Fibronectin以及CollagenIV组CD34阳性细胞数分别达到(7.18±0.32)%、(9.59±0.4)%、(14.42±0.69)%,CollagenIV组高于前2组(P<0.05);3个组中CD45阳性细胞数分别达到(0.04±0.005)%、(0.05±0.01)%、(1.49±0.08)%,CollagenIV组高于前2组(P<0.05);3个组中CD34和CD45双阳性的细胞比例分别为(0.08±0.006)%、(1.16±0.12)%、(7.8±0.32)%,CollagenIV组显著高于前2组(P<0.05);而3组中CD31阳性以及CD34和CD31双阳的细胞数占有的比例无显著的差异(图3).在对照组细胞未检测到CD34、CD31和CD45的阳性表达.
实时定量PCR分析造血细胞特异性基因的表达从图4可以看出,随着诱导分化启动,ES细胞多能性标志物Oct4和Nanog在各组细胞中的表达迅速下降至消失(图4A,4B),而中胚层标志物Brachyury、血液成血管细胞标志物Flk1以及造血系统特异性基因CD34和转录因子SCL在人ES细胞中(即分化第0d)几乎不表达,分化第3d时Brachyury的表达量达到最高值,后逐渐下降直至消失,3组之间未见显著差异(图4C);3组Flk1的表达在分化第7d达高峰,3组Flk1相对表达量分别为25.74±3.65,27.83±2.41和63.03±7.99,且Matrigel和Fibronectin组显著低于CollagenIV组(P<0.05),此后Flk1的表达开始下调(图4D);随着诱导天数的增加,CD34和SCL表达均呈上调趋势,分化第14d时CollagenIV组的相对表达量分别为82.63±10.01和37.5±7.57,明显高于Matrigel和Fibronectin组,差异具有显著的统计学意义(P<0.01和P<0.05)(图4E,4F).在对照组细胞未检测到特定基因的表达.
讨论
定向诱导分化是人ES细胞研究的重要内容,将人ES细胞诱导为造血细胞常采用传统的基质细胞共培养和拟胚体诱导法,但是这些方法繁琐,重复性查,获得的细胞数量有限,而且分化体系中添加了成分不确定的胎牛血清,致使难以研究分化机制,也限制了其临床应用.本实验采用人ES细胞直接贴壁分化的诱导策略既没有拟胚体复杂的三维结构,也不存在基质细胞或胎牛血清的动物源性污染,缩短与临床应用的距离,同样可以有效地产生造血祖细胞,这一方法成功的关键是胞外基质的选择.研究表明,细胞微环境对维持人ES细胞自我更新以及细胞命运的决定极其重要,其中胞外基质是重要组成部分[5].胞外基质不但为细胞提供生长分化的支架,也提供维持细胞存活、迁移和命运决定的调控因子.胞外基质通常是大分子糖蛋白,包括基质胶(matrigel)、纤维黏连蛋白(fibrobectin)、胶原蛋白(collagen)、层黏连蛋白(laminnin)和蛋白多糖等.
本实验采用人ES细胞接种至基质胶、纤维粘连蛋白和IV型胶原蛋白这3种胞外基质包被过的培养板上直接贴壁分化的诱导方法,产生的CD34+造血祖细胞最高达到15.06%,表达CD45的造血祖细胞可达7.8%,与传统的基质细胞共培养和拟胚体法的分化效率相似,但是这一诱导方法简单易操作,而且无血清、无基质细胞的培养体系更接近于未来的临床应用.
造血过程中多种生长因子发挥着重要作用,外源性添加生长因子在一定程度上能模拟体内的造血微环境,促进造血发生.国外文献报道,人ES细胞向造血细胞分化过程中需全程添加细胞因子,包括BMP4、bFGF、VEGF、SCF、Flt3L、IL-3和IL-6等[6,7].既往研究表明,人ES细胞向造血细胞分化过程中,只有BMP4能诱导产生对中胚层造血细胞发育必需的原条样细胞群,启动造血中胚层基因表达和少量造血祖细胞的产生;BMP4、VEGF、SCF和bFGF共同作用则诱导出高效的造血细胞[8].近年有研究证实,在人ES细胞向造血系分化过程中序贯加入不同的细胞因子更能有效地产生造血祖细胞[9].本研究整个分化过程中细胞因子分两步添加,第1步加入BMP4、VEGF和bFGF,第2步加入SCF、Flt3L、IL-3和IL-6,诱导14d后对分化细胞进行鉴定,造血集落形成、流式细胞分析术以及实时定量PCR结果均证实人ES细胞有效地分化为造血祖细胞.本研究中外源性造血生长因子的添加诱导人ES细胞开始分化,实时定量PCR结果显示所有实验组分化细胞中干细胞多能性标志物Oct4和Nanog表达呈急剧下降的趋势,尽管分化早期诱导效率很低,但是中胚层标志物Brachyury、血液成血管细胞标志物Flk1以及造血系统特异性转录因子SCL和基因CD34的相对表达量对于内参基因β-actin仍呈成倍增长,这是ES细胞一旦启动分化,未分化状态和多能性特性迅速丧失的结果[10].
本研究还比较了基质胶、纤维黏连蛋白和IV型胶原蛋白对产生造血细胞的不同作用.基质胶多用于人ES细胞无饲养层培养的培养皿处理[11],也可用于人ES细胞的贴壁诱导向造血细胞的分化[12].
纤维黏连蛋白和IV型胶原蛋白支持小鼠ES细胞来源的表达Flk1的祖细胞向造血细胞分化[13].纤维黏连蛋白能促进中胚层分化,诱导人ES细胞来源的内皮祖细胞向内皮细胞分化[14].IV型胶原蛋白也能促进中胚层发育,诱导人ES细胞向内皮、心血管和造血系的分化[15],但具体的分化效率并未报道.本研究中造血集落形成实验显示这3种胞外基质上培养诱导的细胞均具有造血干/组细胞的造血集落形成能力,而且IV型胶原蛋白上形成的造血CFC数目明显高于其它两组.流式细胞术分析显示IV型胶原蛋白组CD34+和CD34+CD45+细胞数量显著大于基质胶组和纤维黏连蛋白组;实时定量PCR结果显示IV型胶原蛋白组造血特异性基因CD34和SCL的相对表达量最高.由此证实,采用人ES细胞直接贴壁的诱导方法选择IV型胶原蛋白更利于向造血细胞分化.
本研究建立了一种人胚胎干细胞在胞外基质上直接贴壁培养、有效地分化为造血祖细胞的新诱导方法,为造血祖细胞的大量产生以及进一步分化产生其它功能性血细胞提供足够的细胞来源,同时发现IV型胶原蛋白利于人胚胎干细胞向造血细胞诱导,为胚胎干细胞的定向诱导分化提供技术平台.
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