- 相关推荐
高氧对肺损伤患儿的影响研究
氧疗是提高早产儿存活率的有效方法，但是长时间高浓度吸氧可导致肺损伤，下面是小编搜集的一篇关于高氧对患儿肺损伤影响探究的论文范文，供大家阅读参考。
近年随着科技的进步，越来越多的极度早产儿和极低出生体质量儿幸存下来，但是由于长期吸入高浓度氧，患儿可发生肺损伤，严重者甚至发生支气管肺发育不良(BPD)[1,2].目前，高氧性肺损伤的机制尚不清楚，最近研究的热点主要集中在氧化应激方面[3,4],而NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)在氧化应激及DNA损伤修复中发挥重要作用[5].本研究在前期实验基础上，通过建立高氧损伤人肺泡上皮细胞(HPAEC)模型[6],探讨SIRT1转位是否介导肺泡上皮细胞发生凋亡，从而为减轻高氧肺损伤寻找新的治疗靶点。
1材料与方法
1.1细胞、仪器及试剂HPAEC细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司。LX71型倒置相差显微镜购自Olympus公司，FORMA311型CO2培养箱、胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gibco公司，ANNEXINV流式细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司，单克隆小鼠抗SIRT1抗体购自博士德生物公司，罗丹明标记山羊抗小鼠IgG购自ZSGB-BIO公司，DAPI购自碧云天生物公司，抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物公司，单克隆小鼠抗SENP1抗体与单克隆抗乙酰化p53lys(382)抗体购自Abcam公司，ECL化学发光试剂购自北京普利莱基因技术有限公司。
l.2HPAEC细胞培养先将HPAEC细胞复苏，加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，放入37℃、含5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，用0.25%的胰蛋白酶进行消化，传代培养。
1.3HPAEC细胞分组及高氧干预取对数生长期的细胞，消化后传代接种于培养瓶中，随机分为高氧组、对照组。对照组不作处理，放置于50mL/LCO2培养箱中培养;高氧组换液1次后，以3L/min的速度通入含900ml/LO2和50mL/LCO2高纯混合气，通入时间为10min,参照我们前期高氧模型建立的方法[6].分别培养24h(高氧组细胞干预24h后，使用测氧仪检测培养瓶中氧浓度，如果氧浓度<90%则弃去该标本),之后收集HPAEC细胞。
1.4HPAEC细胞凋亡情况观察两组细胞培养24h后，收集细胞，用流式细胞仪检测，按照凯基ANNEXINV-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。
1.5HPAEC细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化，并照相。
1.6HPAEC细胞SIRT1蛋白转位情况观察将HPAEC细胞消化后，按细胞密度为2×104/孔接种于6孔板中盖玻片上培养，同步化细胞，两组均加入1mL培养基，高氧组另通入高浓度氧，分别培养24h;多聚甲醛固定细胞10min;0.3%TritonX-100打孔10min;5%封闭血清在37℃封闭30min;将稀释的抗体SIRT1(终浓度为1∶100)滴加在细胞爬片上，4℃冰箱孵育过夜，在避光情况下将罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG(终浓度为1∶50),37℃湿盒中孵育60min;用PBS洗涤3次，滴加DAPI复染，免疫共聚焦显微镜下观察并照相;每张细胞爬片截取5个视野，每组8张爬片，并照相，计算细胞转位率。
1.7HPAEC细胞SENP1、乙酰化p53蛋白检测采用Westernblotting法。两组细胞培养干预24h(细胞生长80%融合),胰酶消化后PBS冲洗，离心并移去上清。加入200μL裂解混合液，冰浴30min,离心取上清，电泳、转膜，加入一抗，再加入显色的二抗，以TBST清洗，使用ECL进行结果的显影，然后用Labworks4.6分析目的条带的灰度值。
1.8统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
高氧组和对照组细胞凋亡率分别为24.77%±2.17%、5.33%±2.60%,两组比较，P<0.05.高氧组细胞从正常的长梭形、多角形变成圆形、椭圆形，细胞间的间隙增宽，悬浮的细胞较多;对照组细胞大多为长梭形、多角形，贴壁较好，细胞间的间隙较小，悬浮的细胞较少。高氧组和对照组细胞SIRT1蛋白转位率分别为88.89%(96/108)、16.23%(25/154),两组比较，P<0.05.高氧组和对照组细胞SENP1蛋白相对表达量分别为0.76±0.12、0.67±0.02,乙酰化p53蛋白相对表达量分别为0.81±0.07、0.52±0.03,两组比较，P均<0.05.
3讨论
近年来，早产儿的出生率逐年增高，早产儿中大部分会发生夭折，氧疗是提高早产儿存活率的有效方法，但是长时间高浓度吸氧可导致肺损伤，从而导致BPD的发生[7].活性氧簇(ROS)增多所致的氧化应激损伤是早产儿高氧肺损伤发生的主要机制[8],而SIRT1蛋白能显着降低ROS水平和促进细胞生存[9].
SIRT1蛋白是一种NAD+依赖性脱乙酰酶，作为哺乳动物生命周期相关蛋白，其主要功能是调节细胞氧化应激反应和调控生命周期。SIRT1蛋白主要定位于细胞核，在细胞能量代谢、DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抗氧化逆境和延长细胞寿命方面发挥重要的调控作用，是机体内抗氧化应激的关键蛋白[10,11].Yang等[12]用紫外线辐射、过氧化氢诱导人肺腺癌细胞后发现，SIRT1蛋白可发生翻译后修饰，在734位赖氨酸上发生小泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰。该修饰决定着SIRT1蛋白在细胞核的定位。这是一个动态的、可逆的过程，其去SUMO修饰的过程则由SENP1介导[13,14].SIRT1蛋白主要存在于细胞核，少量存在于细胞质，当细胞应激时SIRT1蛋白能被SENP1去SUMO化，使p53蛋白的第382位赖氨酸残基去乙酰化减少，抑制p53与靶DNA顺式原件结合，进而抑制p53促凋亡活性[15~18].本研究显示，高氧组细胞生长较差，细胞间隙增宽，悬浮细胞较多，细胞的凋亡率增加，这与我们的前期实验[6]结果一致，即高氧可以诱导细胞凋亡。本研究还显示，高氧组SENP1蛋白表达、SIRT1转位率、乙酰化p53表达均较对照组升高，这与Yang等[12]结果一致。提示高氧可诱导细胞凋亡，其凋亡的机制与SIRT1蛋白相关。
总之，高氧诱导SENP1蛋白表达，促使SIRT1蛋白发生去SUMO化，发生核质转位，去乙酰化活性减低，对p53去乙酰化活性减低，乙酰化p53相对增加，从而激活下游的凋亡通路而介导细胞凋亡。
参考文献：
[1]HilgendorffA,ReissI,EhrhardtH,etal.Chroniclungdiseaseinthepreterminfant.Lessonslearnedfromanimalmodels[J].AmJRespirCellMolBiol,2014,50(2):233-245.
[2]JinL,YangH,FuJ,etal.AssociationbetweenoxidativeDNAdamageandtheexpressionof8-oxoguanineDNAglycosylase1inlungepithelialcellsofneonatalratsexposedtohyperoxia[J].MolMedRep,2015,11(6):4079-4086.
[3]SchumackerPT.Lungcellhypoxia:roleofmitochondrialreactiveoxygenspeciessignalingintriggeringres-ponses[J].ProcAmThoracSoc,2011,8(6):477-484.
【高氧对肺损伤患儿的影响研究】相关文章：
辽代玉器的形成对中国玉文化的影响研究论文02-28
研究淤地坝工程施工对生态环境的影响01-26
音乐对舞蹈作品的影响05-29
音乐对人生的影响论文04-20
韩愈的师说及其影响10-19
浅谈电商对物流的影响02-24
魏晋审美意识对后世的影响04-20
浅谈《诗经》的艺术成就及影响论文04-13
柏拉图的理念论内容及其影响01-22