88Arg IL-2的克隆构建及原核表达

时间：2022-12-10 22:31:33 论文范文我要投稿

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作者：孟林刘明军王斌钱冬萌

【关键词】白细胞介素2;基因突变;原核表达;蛋白质印迹法;MTT比色法
　　［摘要］目的构建88Arg IL-2的重组克隆，并在大肠杆菌中表达。方法根据天然IL-2的基因序列设计含目的突变位点的引物，经PCR定点诱变技术获得 88Arg IL-2的重组克隆，插入原核表达质粒pGEX4T-2中，经IPTG诱导在大肠杆菌DH5α中表达88Arg IL-2与GST的融合蛋白。结果所表达的蛋白相对分子质量约为 42 000 。Western blot检测结果表明，该蛋白具有与亲本IL-2相同的抗原性。MTT比色结果表明，88Arg IL-2可促使IL-2依赖细胞株CTLL-2生长，具有与亲本IL-2相近的生物学活性。结论成功构建了88Arg IL-2的重组克隆，在原核表达系统中高效表达出融合蛋白，并且具有生物学活性。
　　［关键词］白细胞介素2;基因突变;原核表达;蛋白质印迹法;MTT比色法
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo construct clone of88Arg IL-2 and express it in Escherichia coli. MethodsSite-specific mu-tated primers were designed according to natural IL-2 DNA sequence.88Arg IL-2 gene was amplified using PCR. Then the88Arg IL-2 gene was inserted into expression vector pGEX4T-2 and induced by IPTG to express the protein in E. coli DH5α. ResultsThe molecular weight of fusion protein was 42 000. Western blotting test revealed that it had good specificity to anti-IL-2. The result of MTT assay indicated that88Arg IL-2 could stimulate the proliferation of CTLL-2 which was IL-2-dependent cell strain. Conclusion88Arg IL-2 has been cloned; the fusion protein is expressed in prokaryotic expression system with biologic activity.
　　［KEY WORDS］interleukin-2; gene mutation; prokaryotic expression; immunoblotting; MTT assay
　　白细胞介素2（IL-2）可诱导T细胞增殖分化，增强CTL的细胞毒性，促进NK细胞、LAK细胞增殖并增强其活性等［1～3］。临床上已经开始使用基因重组IL-2（rIL-2）作为治疗多种恶性肿瘤的药物［3］。但IL-2对靶受体的选择性不高，当与NK细胞表面的中度亲和力受体结合时，会导致NK细胞的过度活化，产生过量肿瘤坏死因子（TNF），从而导致系统毒性。因此，利用IL-2基因定位诱变技术，获得既保持其原有生物学活性又增强对靶细胞作用特异性的变构体就显得尤为重要。本实验利用PCR定点诱变技术，将编码IL-2的第88位酸性氨基酸天冬酰胺（Asn）变构为碱性氨基酸精氨酸（Arg），并将其构建成稳定的原核表达克隆，在此基础上对变构IL-2（88Arg IL-2）融合蛋白进行了抗原性和生物学活性测定，为进一步研究其受体结合特异性，并将其开发成为新型的抗肿瘤免疫药物奠定基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与试剂IL-2克隆由本教研室构建。原核表达载体pGEX4T-2、菌株E.coli JM109和E.coli DH5α均由本教研室保存。pGEM-T Easy载体、PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒均购自Pro-mega公司。rhIL-2购自晶美生物公司。Anti-hu-manIL-2（Monoclonal antibody）购自PeproTech EC Ltd。Goat Anti-mouse IgG （γ chain specific）购自Southern Biotech Associates， Inc。MTT为Pro-mega公司分装，TRIZOL试剂为Invitrogene公司产品。
　　1.2 方法
　　1.2.188Arg IL-2基因克隆的构建及序列测定用于构建IL-2基因克隆的引物为上游引物（P3）:5′- ACAATGTACAGGATGCAACT-3′，下游引物（P4）: 5′-TAATTATCAAGTTAGTGTTGA-3′。设计含突变位点的反向互补引物P5、P6。P5:5′-GACT-TAATCAGCCGTATCAACGTAATA-3′，P6: 5′-TATTACGTTGATACGGCTGATTAA-GTC-3′。使用上述4条引物经PCR定点诱变技术得到变构基因片段P3/P6、P5/P4，两纯化片段部分互补，以此为模板，以P3、P4为引物行PCR扩增获得88Arg IL-2基因。PCR产物纯化后与T-Easy Vector连接，重组质粒标记为T-Easy/IL-2（sa），转化至E.coli JM109，选择阳性克隆，送至上海生物工程技术有限公司进行序列测定。
　　1.2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达克隆构建和鉴定根据88Arg IL-2基因序列，设计合成2条引物，IL-2上游引物:5′-GTCAGAATTCCCGCAC-CTACTTCAAGTTCGACA-3′，IL-2下游引物:5′-CACTGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG-ATG-3′。其中在IL-2上游引物的5′端引入EcoR Ⅰ的酶切位点和4个保护碱基，IL-2下游引物的5′端引入终止密码子、Sal Ⅰ的酶切位点和4个保护碱基。PCR产物应用Promega公司Wizard DNA Clean-up纯化后用EcoR Ⅰ和SalⅠ进行双酶切后回收，同时对表达载体pGEX4T-2也用上述酶进行双酶切后回收，用T4 Ligase将两者连接后，转化至E.coli DH5α中构建pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达克隆，再对重组载体进行EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切鉴定。
　　1.2.388Arg IL-2融合蛋白的表达和纯化挑取含pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒的E.coli DH5α接种于LB培养液中（含100 mg/L氨苄青霉素），在37 ℃下振荡培养至 A600约为0.6。加诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L，37 ℃继续培养4 h。收集菌液，将菌斑超声裂解。离心分离上清和沉淀，分别在 120 g/L SDS-PAGE凝胶中电泳。将电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染液染色，观察表达情况。另按上述方法经超声裂解细菌，收获大量上清液，加入GST Fusion Protein Purification bead振荡30 min浓缩纯化，以得到纯化的pGEX4T-2/88Arg IL-2蛋白。
　　1.2.488Arg IL-2融合蛋白的Western blot鉴定将电泳后的含表达蛋白和标准相对分子质量蛋白Marker的凝胶用电转仪（BIO-RAD公司产品）转至PVDF膜上。电转结束后，切下Marker膜条，用丽春红染液染色备用。余下的膜条，用IL-2单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（二抗）在转移后的PVDF膜上行酶免疫固定检测88Arg IL-2的抗原性。
　　1.2.5MT T比色法检测88Arg IL-2生物学活性用含体积分数0.1胎牛血清的RPMI 1640液体调整CTLL-2细胞浓度为（3～5）×108 /L，96孔板中每孔加100 μL，将纯化后的变构IL-2定量到5 g/L，然后以此为原液进行倍比稀释，设7个稀释度，每个稀释度做3个复孔，同时设阳性对照孔（每 100 μL中加入10 U rhIL-2标准品）、空白对照（加入培养液），37 ℃ CO2 培养24～48 h，待空白对照孔细胞95%死亡时，加入MTT 20 μL（50 g/L），继续培养 4 h后，每孔再加入二甲基亚砜（DMSO） 200 μL终止反应，微量振荡器振荡10 min，在酶标仪上检测 570 nm 波长处各孔吸光度（ A ）。
　　2 结果
　　2.188Arg IL-2基因PCR产物鉴定及序列测定88Arg IL-2的PCR产物为472 bp（图1）。基因测序结果进一步证实，插入的基因序列完全正确，并保证了插入基因的正确阅读。
　　2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达载体的酶切鉴定 pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒经PCR鉴定、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定后获得了大小相符的片段（图1）。
　　2.3重组质粒pGEX4T-2/88Arg IL-2在E.coli DH5α中的表达和初步纯化将含pGEX4T-2/88Arg IL-2重组体的E.coli DH5α经IPTG诱导，并用超声粉碎处理菌体后进行SDS-PAGE电泳，同时设空菌、空质粒对照。结果在相对分子质量为42 000位置有明显的融合蛋白表达条带，并确认表达的融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体中（见图2）。经GST Fusion Protein Purification bead纯化后的融合蛋白电泳条带见图3。
　　2.4 Western blot鉴定 Western blot检测结果表明，在相对分子质量为 42 000处，未经纯化的融合蛋白和纯化的融合蛋白均有一特异的棕色条带（图4），证明 88Arg IL-2融合蛋白与市售IL-2单克隆抗体发生特异性反应，说明纯化的88Arg IL-2融合蛋白保持天然的抗原性。

2.5MTT比色法检测88Arg IL-2的生物学活性88Arg IL-2与市售rhIL-2标准品都有维持CTLL-2生长的活性。见表1。
　　
　　图1 88Arg IL-2基因PCR产物及pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒的酶切鉴定（略）
　　M为DL 2 000 Marker;①为IL-2基因;②为P5/P4片段;③为P3/P6片段;④为88Arg IL-2基因克隆插入T-A载体后PCR鉴定结果;⑤为pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达载体EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定
　　图2 SDS-PAGE电泳结果（略）
　　①为DH5α诱导前;②为pGEX4T-2-DH5α诱导前;③为重组质粒-DH5α诱导前;④为DH5α诱导后;⑤为pGEX4T-2-DH5α诱导后;⑥为重组质粒-DH5α诱导后
　　图3 融合蛋白纯化的结果（略）
　　M为蛋白Marker;①为重组质粒-DH5α诱导前;②为重组质粒-DH5α诱导后;③为纯化的融合蛋白
　　图4 Western blot鉴定结果（略）
　　M为蛋白Marker;①为诱导细菌总蛋白的印迹;②为纯化融合蛋白印迹
　　表1 不同稀释度88Arg IL-2的吸光度（略）
　　
　　3 讨论
　　IL-2是20世纪90年代获准上市的重组基因工程药物。在自然状态下，IL-2具有免疫活性，可以刺激机体的CTL细胞和NK细胞产生干扰素，这种内源性的干扰素可以使单核-巨噬细胞发生活化，产生TNF-α，导致肿瘤细胞的程序性死亡。IL-2对于其靶受体的选择性不高，在与中度亲和力受体结合后，会导致NK细胞的过度活化，从而产生过量TNF-α，杀伤正常细胞。近年来，国内外将研究热点放在对IL-2进行基因变构上，以期获得高活性和高特异性的突变IL-2替代品。JU等［4］通过定位诱变得到50多种不同的突变体，分析它们的活性后证实在IL-2分子中有3段序列对维持其活性是必需的:①N端第1～20位氨基酸;②C端第123～133位氨基酸;③58位和105位Cys。N端、C端及中央的30～60位氨基酸组成了IL-2与其受体的结合部位，这些部位的氨基酸突变均可影响其受体的识别。ARAKAWA等［5］将IL-2分子中第125位的Cys突变成Ala或Ser，转化至大肠杆菌后产生的IL-2具有与天然IL-2分子相同或更高的活性，而且生产方便。目前国外125Ser-IL-2已经FDA批准生产，125Ala-IL-2也已批准临床试用。但这些点突变未能明显改善与受体特异性结合的问题。ARMEN等［6］研究发现，在基因水平对IL-2进行特定位点的定位诱变，将编码几个特定位点的酸性氨基酸变为碱性氨基酸，可以显著改变与IL-2受体α、β、γ链结合的亲和力，从而增强变构IL-2与机体抗肿瘤免疫的主要细胞―― ―CTL细胞的活化，而减弱非特异性的NK细胞杀伤作用。本实验室构建了变构IL-2（88Arg IL-2）的基因克隆，并在原核表达系统中高效表达了该蛋白的融合蛋白且获得了纯化的融合蛋白。该88Arg IL-2与目前市售IL-2单克隆抗体可发生特异性抗原抗体反应，提示该点突变对IL-2的抗原性没有影响。在此基础上，利用MTT比色法检测了 88Arg IL-2促进IL-2依赖CTLL-2细胞株生长的作用，结果显示，88Arg IL-2与天然IL-2有相近的生物学活性。但在本研究中，未能获得HPLC纯的非融合88Arg IL-2，暂时不便比较 88Arg IL-2与天然IL-2的活性高低。这将在今后的研究工作中进一步补充完善，并将探索比较其在激活CTL细胞、NK细胞、LAK细胞等方面的作用优势。
　　［参考文献］
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　　［4］ JU G， COLLINS L， KAFFKA K L， et al. Structure-function analysis of human interleukin-2［J］. J Bio Chem， 1987，262:5723.
　　［5］ ARAKAWA T， BOONE T， DAVIS M. et al. Structure of unfolded and refolded recombinant derived ［Ala 125］ interleu-kin 2 ［J］. Biochemistry， 1986，25:8274.
　　［6］ ARMEN B， HANAFELT S. A T-cell-selective interleukin-2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo［J］. Nature Bio， 2000，16:1197.

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