固定时间对原位杂交的影响
作者：马云 张连国 张辉 周翠玲 刘颖
【摘要】 目的 研究组织固定时间对原位杂交的影响。方法 选择了18个固定时间点的胃癌组织标本，用两种探针进行原位杂交实验。结果 固定时间为8～24 h胃癌组织胞核阳性细胞个数及平均光密度为（84/0.40），明显高于其它组；固定时间为6～16 h胃癌组织胞浆阳性细胞个数及平均光密度为（84/0.40），明显高于其它组。结论 胃癌组织胞核阳性最佳固定时间为8～24 h，胃癌组织胞浆阳性最佳固定时间为6～16 h。
【关键词】 固定时间 原位杂交
【Abstract】 Objective To study the effect of fixing tissue at different time on ISHH.Methods The experimental tissues fixed with different time were divided into 18 groups, which were examined the mRNA expression of p53，c?myc using ISHH .WTHZ]Results The number of positive neurons and average optical density value of tissue fixed for 8?24 h were higher than that of others. The number of positive cytoplasm and average optical density value of tissue fixed for 6?16 h were higher than that of others.Conclusion The best time of fixing tissue neurons is 8?24 h for ISHH,the best time of fixing tissue cytoplasm is 6?16 h for ISHH.
【Key words】 time of fixing tissue, ISHH
原位杂交（ISHH）属于固相分子杂交范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法,它不仅保持了细胞固有形态而且对被测物准确定位。因此，ISHH已被广泛应用于肿瘤的鉴定、预后分析及相关学科的研究之中。研究发现［1，2］，不同固定剂对原位杂交结果有明显影响，作者在长期的工作中发现组织固定时间亦是影响杂交结果的重要因素。本文选择了18个固定时间点的胃癌组织标本，用探针进行研究，拟寻找适用的固定时间段，为提高原位杂交染色方法的准确性和稳定性提供参考依据.
1 材料与方法
1.1 材料 胃癌标本30例为病理科送检标本，每例取大小为1 cm×2 cm×0.2 cm组织块若干固定于多聚甲醛中,固定时间分别为1、2、4、6、8、12、16、24、48、72 h间及1、2、4、8、12、24、48、72周。P53 、c?myc杂交试剂盒为北京中山公司产品。
1.2 方法 原位杂交：切片58 ℃烘烤过夜,二甲苯脱蜡6 h，梯度酒精水化，DW洗片，PB洗片，0.1DHCL室温10 min，PB洗片，微波(甘氨酸?盐酸缓冲液)处理，三乙醇胺?无水乙酸处理，梯度酒精处理，风干后滴加探针42 ℃杂交20 h，42 ℃ 2×SSC洗片，37 ℃ 0.1×SSC洗片，滴加辣根酶标记的Dig抗体37 ℃孵育 2 h，PB洗片,滴加SABC 37℃ 1 h,PB洗片, DAB 显色，甲基绿或苏木素复染。
1.3 图像分析 每片组织随机取10个阳性视野，以测出平均视场（261 632 μm2）内的阳性细胞个数及阳性信号的平均光密度。
2 结果
对固定24 h的组织原位杂交方法预实验3次，在30例送检标本选出8例p53 、c?myc杂交均阳性标本，对这8例标本的切片按所设计实验近一步研究。
各不同固定时间组对所测探针均有不同程度的表达见表1。将每个实验时间点的平均阳性细胞数及平均光密度进行分析统计，可见：对于胞核呈阳性的组织，固定时间在1～8 h内曲线呈上升趋势，8～24 h到达峰值，24 h后曲线呈下降趋势，至100 h后曲线开始平缓，由此可知，原位杂交中组织胞核阳性最佳固定时间为8～24 h(图1)；对于胞浆呈阳性的组织，固定时间在1～6 h内曲线呈上升趋势，6～16 h到达峰值，16 h后曲线呈下降趋势，至100 h后曲线开始平缓，由此可知，原位杂交中组织胞浆阳性最佳固定时间为6～16 h（图2）。
图1 固定12 h的组织 P53胞核阳性(×400)（略）
图2 固定6 h的组织，c?myc胞浆阳性(×400)（略）
3 讨论
多聚甲醛是通过醛基与组织内的某些蛋白质成分发生交联反应，迅速终止组织内各种酶活性，从而防止细胞自溶，保存细胞的固有形态。但这样广泛的交联而掩盖了特定核酸序列，影响杂交探针与被测基因结合位点的整合。固定时间适当可应用微波或蛋白酶打开交联恢复蛋白质原有的结构，重新暴露特定核酸序列，但固定时间太短又导致组织固定不足，使组织中心部位的特定核酸序列溶解、弥散、丢失。一旦固定时间过长，可使被测基因片段的结合点被牢固封闭，故组织固定时间是特定核酸序列能否得到良好保存、ISHH能否成功的关键因素。
本实验显示，固定时间与原位杂交的结果密切相关，当组织固定不好(0.5 h固定组)所测探针没有表达，固定达1 h后,表达率与时间开始呈正相关.胞浆阳性达6 h后到高峰，直至16 h后慢慢下降与时间呈负相关,胞核阳性8 h间后至高峰直至24 h后慢慢下降与时间呈负相关,这可能与多聚甲醛的固定机制有关。多聚甲醛溶液实际上是新鲜配制的甲醛液，甲醛溶解时大部分分子水合成水化甲醛，分子较大，主要固定组织的表面结构，而小分子的甲醛主要是靠物理扩散，或者其趋脂性渗入到组织中并与其内部含有氨基的物质发生交联反应，如果固定时间太长，固定液与组织的交联反应过重，势必影响实验结果。
【参考文献】
［1］ 马云，张燕，孙长华,等.固定液对原位杂交的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2002,11(3):345.
［2］ 翟为溶,张锦生.现代组织化学的原理及应用［M］.上海:上海科学技术文献出版社,1998:182.
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