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青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测
【摘要】 目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因突变的情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应单链构象多态性(PCRSSCP)技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段，69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株，其中耐药株13株，敏感株5株;SSCP泳动正常者51株，其中耐药株14株，敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCRSSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA 的突变，可弥补常规药敏试验的不足。
【关键词】 分支杆菌 结核 基因 pncA BACTEC培养方法 聚合酶链反应 单链构象多态性
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis, the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC460 system, and the mutations of pncA gene detected by PCRSSCP.ResultsAmong the 76 isolates, 44 strains were PZAsensitive and 32 PZAresistant by the BACTEC460 system. With PCRSSCP, 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile, in which, 13 were PZAeresistant and five PZAsensitive. Fiftyone strains displayed normal pncA SSCP profile, in which 14 were PZAresistant and 37 PZAsensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamideresistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCRSSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis, preferable to the routine drugsusceptibility test.
[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; genes, pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; singlestrand conformation polymorphism
近年来,结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，其主要原因之一是耐药菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的涌现。目前对结核分支杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶位及其相关基因的突变位点上。吡嗪酰胺(PZA)自1949年首次用于肺结核治疗以来，作为第一线抗结核药物应用已有50多年的历史。近几年结核分支杆菌临床分离株对其耐药趋势日渐上升，并且呈现与异烟肼和利福平同时耐药的现象[1]。然而，目前对PZA的作用机制及耐药分子机制尚不清楚。本文应用BACTEC460培养系统进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCRSSCP)检测结核分支杆菌pncA基因，旨在了解青岛地区结核分支杆菌耐PZA分离株的pncA基因突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系,以建立新的、快速有效的结核分支杆菌药敏试验方法，弥补常规药敏试验的不足。
1 材料和方法
1.1 标本来源
76例结核分支杆菌临床分离株来自青岛市结核肺病防治研究所2002年1～12月诊治的肺结核病人。其中初治病人60例，复治病人16例;男43例，女33例;年龄21～83岁，平均52岁。
1.2 主要试剂与仪器
结核分支杆菌标准株(H37Rv)购自中国药品生物制品检定所，BACTEC460培养系统试剂购自BECTONDICKINSON公司，dNTP、 TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均购自Promega公司，PCR扩增仪为PE公司480型。
1.3 痰标本的处理及PZA药敏试验
根据文献[2]的方法进行菌种鉴定和药敏试验。痰标本经消化、离心，接种至含有C14棕榈酸的12B培养基，37 ℃培养。第1周上机检测生长指数(GI)值2～3次，以后每周测定1次，至第6周。结果判定标准如下：GI值0～10，培养阴性;GI值11～50，培养阳性;GI值51～100，可进行结核分支杆菌复合群与非结核分支杆菌鉴定;GI值500～800，可进行药物敏感性试验。
结核分支杆菌阳性标本一部分提取DNA，-20 ℃保存备用;另一部分在12B培养基内加入定量PZA进行药敏试验，同时以蒸馏水代替PZA作为对照。按以下标准判定结果：对照组的生长指数(AGI) 值>测试组的生长指数(△GI)值为敏感;AGI值<△GI值为耐药;AGI值=△GI值为临界。
1.4 PCR检测结核分支杆菌IS6110及pncA基因
1.4.1 PCR引物的设计与合成 根据Gene Bank中结核分支杆菌标准株H37Rv全基因序列,利用DNAStar软件分别设计对应于结核分支杆菌复合群保守序列IS6110及pncA基因序列的 PCR引物。其中引物INS1和INS2扩增IS6110基因，引物pncA1和pncA2扩增pncA基因。引物序列及扩增片段长度见表1。引物由上海生工生物公司合成(PAGE纯化)，纯水稀释分装，保存于-20 ℃备用。
1.4.2 目的基因的PCR扩增 取经BACTEC460培养系统培养阳性的增菌液1.5 mL于无菌干燥玻璃试管中，酚氯仿法提取DNA。以提取的DNA为模板进行PCR扩增，其循环条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环;72 ℃延伸10 min。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。表1 引物序列及其产物
1.5 PCRSSCP分析
pncA的PCR扩增产物变性后经80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后可见野生型的单链DNA与H37Rv标准对照的单链DNA位于同一位置，而突变型的单链DNA低于或高于H37Rv标准对照的单链DNA水平，以此来确定突变例数。
2 结 果
2.1 BACTEC460培养系统检测
从130份临床痰标本中共检出76株结核分支杆菌，阳性率为58.5%。其中对PZA敏感44株，耐药32株，耐药率为42.1%。
2.2 PCR扩增
本文76株结核分支杆菌临床分离株均扩增出IS6110基因(245 bp)的目的条带，与H37Rv标准株一致，表明这些临床分离株均为结核分支杆菌。69株扩增出pncA基因的特异序列(254 bp)。7株未检出pncA基因扩增产物，其中耐药5株，敏感2株(图1)。
2.3 PCRSSCP检测结核分支杆菌pncA基因突变的结果
以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照，69株结核分支杆菌临床分离株中，SSCP泳动异常者18株，其中耐药13株，敏感5株;泳动正常者51株，其中耐药14株，敏感37株(图2)。
2.4 PCRSSCP与BACTEC460培养系统药敏试验结果比较
BACTEC460培养系统药敏试验结果显示，低度耐药有8株SSCP泳动异常，13株SSCP泳动正常;高度耐药有5株SSCP泳动异常，1株 SSCP泳动正常。PZA耐药株pncA基因突变率为48.1%(13/27)，PZA敏感株pncA基因突变率为11.9%(5/42)。 BACTEC460培养系统PZA药敏结果与PCRSSCP基因突变分析结果比较，差异无显著性(χ2=3.37,P>0.05)。见表2。表 2 BACTEC460 PZA药敏结果与PCRSSCP分析结果的比较
3 讨 论
目前我国结核分支杆菌的实验室诊断主要依靠涂片染色镜检和结核杆菌的培养与鉴定。
痰标本涂片染色镜检法简单、快速，是临床常规开展的方法，但敏感性较低，只能作为筛选。传统的药敏方法依靠直接或间接的含药培养基进行结核分支杆菌的药敏鉴定，仅能反映体外耐药性的程度。由于各个实验室所用培养基不同，检测方法不同，结果判定标准不一，导致报道结果差异。而且由于结核分支杆菌生长缓慢，需较长时间方能获得结果，耗时太长，因而不能满足临床需要[3]。
BACTEC460培养系统是利用分支杆菌能够分解C14棕榈酸，产生14CO2的原理，自动检测培养液中14CO2含量，并换算成GI值，由GI值的高低来判断是否有细菌的生长。此种方法不仅提高了检出率和分离速度，而且大大缩短了实验周期。本实验结果阳性率为58.5%。但由于此方法仍建立在细菌培养基础上，结果回报日期仍较长，加之仪器价格昂贵，又具有放射性污染，在一定程度上限制了其广泛应用，也不能满足现代短程化疗需要。由于PZA药敏试验需在酸性条件下(pH 5.0～5.5)进行，常用的改良罗氏培养基不能用于PZA药敏试验;BACTEC460培养系统检测PZA药敏试验也需用特殊的酸性液体培养基，费用较高，长期以来国内开展PZA药敏常规试验的单位很少，也缺乏统一的方法和判定标准。
目前，结核分支杆菌的耐药机制及耐药的分子基础大部分已被阐明，建立了多种快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子生物学诊断技术。PCRSSCP操作简单、快速，2 d内即可获得测定结果，不需特殊仪器设备和试剂，无放射性污染，无需限制性内切酶，可直接对PCR扩增产物进行多态分析确认单链突变位点，并且检出率相对较高，已成为目前应用最广泛的突变检测技术之一。
结核分支杆菌对PZA耐药性的产生，大量资料主要集中于对PZA酶的编码基因pncA的研究。目前认为pncA基因突变，使PZA酶活性降低或消失，不能将PZA转变为活性型，从而导致结核分支杆菌对PZA产生耐药。pncA基因全长561 bp。其突变分布比较广泛，可分布在启动子区域和结构基因的各个位置。SCORPIO等[4]对9株PZA耐药菌株进行SSCP分析，结果9株的SSCP 带谱与药物敏感菌株有差异，特异性100%。SREEVATSAN等[5]检测了67株耐PZA分离株，72%有pncA基因突变。HOU等[6]应用 SSCP和DNA测序分析35株PZA耐药菌株，32株有核苷酸的替代、插入和缺失，pncA突变率高达91.4%。国内吴雪琼等[7]利用 PCRSSCP分析74株结核分支杆菌临床分离株的pncA基因，32株PZA敏感株SSCP未发现异常，22株PZA耐药株10株SSCP异常，pncA基因突变率为46%，进一步测序发现有58位和68位密码子改变。李洪敏等[8]检测了134例临床耐5种药物(PZA、链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇)分离株，对其中96株耐PZA分离株通过PCRSSCP技术进行分析，高耐药株有35株出现泳动变位，低耐药株有6株出现泳动变位，耐 PZA分离株总突变率为42.7%。王巍等[9]应用PCRSSCP方法分析117例老年结核病人，pncA基因突变率为41.0%。
本实验结果表明，27株PZA pncA基因扩增阳性的耐药分离株中，13株SSCP带谱存在泳动异常,pncA基因突变率为48.1%(13/27)。比上述国内文献结果略高，但显著低于国外文献结果。可见pncA基因的突变是本地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA的主要分子机制之一。据报道，72%～94%的PZA耐药菌株中可见 pncA基因的丢失、插入或替代[1，6，10]。pncA基因突变的特点不一，是否与地理区域有关，尚需进一步探讨。耐药菌株中有14株SSCP带谱与 H37Rv标准株相同，提示这14株耐药菌株的耐药性可能有其他的机制，如可能因为吡嗪酸在菌体内转移，也可能由于pncA基因的突变不足以引起单链 DNA空间构象的改变[11，12]。PZA敏感菌株中有5株SSCP泳动异常，文献[13，14]也有类似报道，可能为一些沉寂突变，还需进一步用 DNA测序来证明。
BACTEC培养系统药敏结果与PCRSSCP分析结果在判断结核分支杆菌耐药性方面的差异无统计学意义，说明这两种方法在检测PZA耐药性方面结果一致。由于PCRSSCP分析方法2 d内即可获得测定结果，因此可用于快速检测结核分支杆菌PZA药敏试验，弥补了常规药敏试验的不足。但此方法特异性不高，在临床推广应用有一定局限性。
总之，青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA的主要分子机制之一为pncA基因的突变。PCRSSCP技术可快速较准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变，弥补了常规药敏试验的不足。
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