栀子的化学成分及抗白血病活性研究
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【摘要】目的 阐明栀子Gardenia jasminoides Ellis中抗急性淋巴细胞白血病的活性成分。方法 用色谱方法分离栀子中化学成分，用波谱技术(IR，ESI?MS，1H?NMR，13C?NMR)进行结构鉴定，用四唑盐(MTT)比色法测定化合物对白血病细胞（HL?60?人早幼粒细胞白血病、REH?人急性淋巴细胞白血病、 Raji?淋巴瘤）增殖的影响。结果 分离鉴定了8个化合物：β?谷甾醇（1），5?羟基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黄酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），栀子苷（5），去乙酰车叶草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龙胆苷（7），鸡矢藤次苷甲酯（8）。化合物3对3种白血病细胞增殖均表现出了一定的抑制作用，其中对REH细胞系抑制活性最强，IC50为7.5 μg/mL。结论 化合物3具有抗急性淋巴细胞白血病的作用。
【关键词】 栀子 急性淋巴细胞白血病 活性成分 四唑盐比色法
Abstract:Objective To determine the active constituents from Gardenia jasminoides against acute lymphoblastic leukemia. Methods Compounds were isolated and purified by various column chromatographic techniques and their structures were elucidated on the basis of spectral analysis (IR, ESI?MS, 1H?NMR, 13C?NMR). The inhibitory activity against the proliferation of HL?60, REH and Raji cell lines was determined by using MTT assay．Results Eight compounds were isolated and identified as β?sitosterol (1)，5?hydroxy?7，3′，4′，5′?tetramethoxyflavone (2)，Ursolic acid (3), D?mannitol (4)，geniposide (5), deacetylasperulosidic acid methyl ester(6), genipin?1?β?gentiobioside (7) and scandoside methyl ester (8). Compound 3 exhibited inhibitory effects on leukemic cell proliferation in vitro with IC50 of 12.2, 7.5 and 15.4 μg/mL aginst HL?60, REH and Raji cell lines, respectively．Conclusion Ursolic acid might be one of the active ingredients against anti-acute lymphoblastic leukemia conferred by Gardenia jasminoides Ellis.
Key words:Gardenia jasminoides Ellis；acute lymphoblastic leukemia；active constituents；MTT assay
1），5?羟基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黄酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），栀子苷（5），去乙酰车叶草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龙胆苷（7），鸡矢藤次苷甲酯（8），其中熊果酸对白血病细胞增殖表现较强的抑制作用。
1 仪器与材料
Fisher?Johns熔点仪（未校正），SHIMADZU FTIR?8400S红外光谱仪，Bruker AM 500型核磁共振仪， Thermo Scientific LTQ Orbitrap质谱仪，上海亚荣旋转蒸发仪RE 2000，SpectraMax 190酶标仪(美国Molecular Devices公司)，薄层板和硅胶（青岛海洋化工厂），Sephadex LH?20为Pharmacia产品，其他试剂均为分析纯（MTT,美国Sigma公司）。
细胞株：HL?60?人早幼粒细胞白血病、REH?人急性淋巴细胞白血病、Raji?淋巴瘤（北京协和医学院/中国医学科学院基础医学研究所）
栀子样品于2008年3月购自北京同仁堂京北康大家园药店，经林余霖研究员鉴定为栀子Gardenia jasminoides Ellis。植物标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆，编号为R?001。
2 方法
2．1 提取与分离
焦栀子（1 kg）经过粉碎，用体积分数95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩得浸膏100 g，称取硅胶(100～200目)210 g拌样，上硅胶色谱柱,用三氯甲烷?甲醇（体积比100∶1～0∶100）洗脱：三氯甲烷?甲醇（体积比95∶5）洗脱部分可得到化合物1（15 mg）、化合物2（6 mg）、化合物3（18 mg）；三氯甲烷?甲醇（体积比9∶1～8∶2）洗脱得化合物5（1 853 mg）、化合物6（9 mg）、化合物7（8 mg）；三氯甲烷?甲醇（体积比7∶3）洗脱得到化合物8（10 mg）；三氯甲烷?甲醇（体积比6∶4）洗脱得到化合物4（120 mg）。
2.2 活性筛选
粗提物、各组分及化合物以二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成50 mg·mL-1的储备液，-20 ℃保存。临用时用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI?1640培养液稀释，配制所需浓度（终浓度样品中DMSO含量<0.1%）。取对数生长期的肿瘤细胞2×105个/mL，接种于96孔培养板,每孔100 μL,设不同浓度的细胞组、空白对照组、调零组，至终体积为200 μL，每组设6个复孔。接种后，于37 ℃、5% CO2中进行培养。培养48 h后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，孵育4 h后，1 000 r/min离心5 min,小心吸弃培养液，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，充分溶解MTT。酶标仪测定各孔吸光度（A值），其中测定波长为570 nm，校正波长为650 nm。计算生长抑制率。
生长抑制率=给药组A值-调零组A值细胞空白对照组A值-调零组A值×100%3 结果与讨论
3．1 结构鉴定
化合物1:无色片状晶体（三氯甲烷），mp 142～143 ℃。EI?MS m/z：414(M+)，与文献［3］报道数据一致；与对照品β?谷甾醇共薄层层析，两者的Rf值、斑点颜色完全一致。鉴定为β?谷甾醇。
化合物2:无色针晶(石油醚)，1H?NMR(500 MHz，CDCl3) δ：3.96［6H，s，(CH3)2 C3′, C5′?OCH3］，3.93(3H，s，C7?OCH3)，3.89(3H，s，C4′?OCH3), 6.38(1H，d，C8?H)，6.50(1H，d， C6?H)，6.60(1H，br s， C3?H)，7.08(2H，s，C2′?H，C6′?H)，12.72(1H，br s，C5?OH)。以上数据与文献［4］报道一致，确定为5?羟基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黄酮。
化合物3: 白色结晶，mp 269～270 ℃。13C?NMR(DMSO?d6)δ: 38.3(C?1)，23.7(C?2)，76.7(C?3)，38.3(C?4)，52.3(C?5)，21.0(C?6)，32.6(C?7)，38.4(C?8)，46.7(C?9)，38.1(C?10)，24.0(C?11)，124.5(C?12)，138.1(C?13)，41.6(C?14)，30.1(C?15)，21.0(C?16)，46.9(C?17)，54.7(C?18)，28.2(C?19)，27.5(C?20)，26.9(C?21)，36.2(C?22)，22.8(C?23)，16.9(C?24)，16.0(C?25)，15.1(C?26)，23.7(C?27)，178.2(C?28)，21.2(C?29)，23.2(C?30)。上述数据与文献［5］报道一致，与标准品进行薄层层析对照，Rf值一致，鉴定为熊果酸。
化合物4:无色针状结晶，mp 167 ℃。ESI?MS m/z： 181［M?H］-。 IR (KBr)cm-1： 3 260， 2 940，
1 470，1 105，1 030。以上数据与文献［6］报道一致。13C?NMR(DMSO?d6) δ：71.3(C?2,5)，69.6(C?3,4)，63.8(C?1,6),综上所述鉴定为D?甘露醇。
化合物5: 白色粉末(三氯甲烷)，mp 163～164 ℃。ESI?MS m/z：411［M+Na］+。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6 ) δ：7.45(1H，s，H?3)，5.66(1H，brs， H?7)，5.11(1H，d，J=6.8Hz，H?1)，3.66(3H，s，COOCH3),4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上数据与文献［4］报道一致，确定为栀子苷。
化合物6: 无色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：427 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6) δ：7.56(s，H?3)， 5.87(s，H?7)，4.92(d，J=8.5 Hz,H?1)，4.56(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.27(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′ )。以上数据与文献［6,8］报道基本一致，鉴定为去乙酰车叶草苷酸甲酯。
化合物7:无色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：573 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.46(s，H?3)， 5.69(s，H?7)，5.11 (d,J=5.5 Hz,H?1),5.0(d，J=7 Hz，H?1′)，4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上数据与文献［7］报道基本一致，鉴定为京尼平?1?β?龙胆苷。
化合物8:无色粉末（甲醇）。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.35(s，H?3)， 5.64(s，H?7)，5.27(d，H?1)，4.45(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.11(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′)。以上数据与文献［6,8］报道基本一致，鉴定为鸡矢藤次苷甲酯。
3.2 活性筛选结果
活性筛选结果（见表1）显示，化合物3(熊果酸) 对3种白血病细胞增殖均表现出了一定的抑制作用，其中对REH细胞系抑制活性最强，IC50为7.5 μg/mL。
表1 化合物对3种白血病细胞增殖的抑制作用（略）
Table 1 IC50 (50%Inhibitory concentration) of compounds from Gardenia jasminoides Ellis against three different leukemic cell linesIC50/
有关熊果酸对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用此前未见文献报道。本文结果表明，栀子提取物中抑制细胞增殖的活性成分主要在低极性部位，水溶性部分没有显示细胞抑制作用。在分离的得到的化合物中，三萜类成分熊果酸显示出了较强的体外活性，对3种白血病细胞均有一定的抑制作用，尤其对急性淋巴细胞白血病REH细胞株有较强的.抑制作用；而其他化合物均没有细胞抑制作用（IC50值大于160 μg·mL-1）。
民间治疗急性淋巴细胞白血病通常是取30～40个焦栀子加水煎汤。30～40个栀子大约25～35 g，熊果酸在栀子中的质量分数约为0.03%～0.04%［9］，相当于约100 mg左右熊果酸的用量，这一用量可在体内一定程度上达到抑制白血病细胞增殖的起效剂量。因此，熊果酸可能为栀子治疗急性淋巴细胞白血病的一个活性成分。当然，栀子中其他成分在治疗急性淋巴细胞白血病中发挥的作用及其机制可能也不可忽略，例如虽然本文中水溶性部分没有显示直接的抑制白血病细胞增殖的活性，但文献研究发现栀子多糖具有比较广谱的体内抑瘤效应［11-12］，栀子中环烯醚萜有机酸酯类成分具有抗氧化和抗炎活性［12］，这些活性作用可能对急性淋巴细胞白血病的治疗也发挥一定的辅助作用。
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