博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标
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【Abstract】 AIM: To discuss the changes of hydroxyproline and the role of oxidationantioxidation disequilibrium in pulmonary fibrosis induced by bleomycin (BLM) in rats. METHODS: A single dose BLM was intratracheally injected to induce pulmonary fibrosis in rats, so as to observe the changes of tissue hydroxyproline and oxidativestress markers during the process. The animals were killed on the 3rd, 7th, 14th and 28th d separately. The pathological model was evaluated by HE and Masson dyeing method, and the hydroxyproline of lung tissue was determined. At the same time, malonaldehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity, reduced glutathione/oxidized glutathione (GSH/GSSG) ratio of lung tissue were also detected. RESULTS: From 7 d to 28 d, the hydroxyproline of lung tissue was increased in BLM groups compared with that in control groups, especially on the 28th d (P<0.05). On the 7 d and14 d, the tissue MDA were enhanced while the activity of SOD was decreased compared with those of control (P<0.05). The GSH/GSSG ratio was lower than that of control on the 3 d and 7 d (P<0.05). CONCLUSION: Tissue hydroxyproline can be a marker of BLMinduced pulmonary fibrosis. The oxidationantioxidation disequilibrium of cells and matrix may play a role in the pathological process.
【Keywords】 pulmonary fibrosis; hydroxyproline; oxidativestress
【摘要】 目的：观察博莱霉素诱导的肺纤维化模型中组织羟脯氨酸(Hyp)及各氧化应激指标的变化，探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的作用. 方法：二级SD大鼠40只，随机分为模型组与对照组，每组20只. 气管内注入博莱霉素A5（BLMA5）溶液，建立肺纤维化模型. 分别于3，7，14和28 d每组随机抽出5只，处死后取肺脏行HE, Masson染色鉴定模型并测定Hyp含量. 同时分别以八木国夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物（MDA）；改良盐酸羟胺法测定组织总超氧化物歧化酶（SOD）的酶活力；改良荧光法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量；荧光法测定氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量. 并计算GSH/GSSG值. 结果：成功建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型. 各指标在不同时间点出现变化. 模型组Hyp含量于7 d时高于对照组，28 d达到最高（P<0.05）. 模型组MDA含量随时间延长而增加，其中14 d时显著高于对照组（P<0.05），但在28 d时有下降. SOD活力在7 d, 14 d均降低，28 d时上升. 模型组GSH/GSSG在3 d, 7 d显著低于对照组（P<0.05），14 d, 28 d又回升. 结论：Hyp可作为博莱霉素诱导的肺纤维化的一个指标. 博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化伴有氧化损伤，且在不同阶段细胞内、外的氧化抗氧化出现失衡.
【关键词】 肺纤维化；羟脯氨酸；氧化应激
0引言
肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病,目前的治疗方法尚不能改善其不良的预后，加强对肺纤维化机制的研究，并在此基础上发展新的`治疗策略已成为更加迫切的现实需要. 一般认为，在肺部，损伤组织及激发纤维化的主要病理机制在于炎症和免疫反应，但是大量研究表明，氧自由基在炎症和免疫介导的组织损伤中扮演了重要角色［1］. 故本研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型，观察各氧化指标在此过程中的变化，从自由基理论的角度，深入探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的重要作用.
1材料和方法
1.1材料
博莱霉素A5，天津太河制药有限公司产品（批号：030305），8 mg/支. 丙二醛（MDA）标准品（Merk公司）;2Thiobarbituric acid（Merk公司）;磷钨酸（中国医药集团上海化学试剂公司）;盐酸羟胺（AR, 天津化学试剂一厂）;氯化硝基四氮唑蓝，NBT，NEMI（华美公司）;Triton X100（上海试剂一厂）; 7210分光光度计(上海分析仪器厂虹桥分厂);970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）;GL20A全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表离心机厂）.
二级SD大鼠40只，雄性，体质量180~240 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 随机分为模型组与对照组，每组20只.
1.2方法
1.2.1制备模型［2］以10 g/L戊巴比妥钠（10 mg/kg, ip）麻醉大鼠，取仰卧固定位，常规消毒，行颈部正中切口，钝型分离暴露气管，于气管软骨环间隙穿刺注入BLMA5生理盐水溶液0.2～0.3 mL（5 mg/kg），立即将动物直立并行旋转，缝合皮肤，待动物自然清醒后置笼内常规饲养. 对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS)注入气管代之.
1.2.2模型鉴定分别于气管内滴药后第3，7，14和28日处理. 每批每组随机抽出5只，麻醉处死. ①剖开胸腔及颈部，分离气管和肺脏，结扎后取出肺脏，洗去血渍，去除结缔组织，吸干水分；②从气管插管至左主支气管，结扎固定. 分离结扎右主支气管后离断，取右上叶置体积分数为40 g/L甲醛中固定1 wk，行HE和Masson染色［3］.
1.2.3肺脏羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量测定参考杨陟华等［4］的方法，将肺组织样品剪碎，置于磨口试管中，用6 mol/L HCl (W∶V＝1∶4)水解(125℃) 3 h后，稀释至10 mL，过滤. 取滤液0.1 mL(空白管和标准管分别用蒸馏水和标准Hyp代替)加蒸馏水到1.0 mL，充分氧化，加入0.5 mL柠檬酸缓冲液(0.25 mol/L，pH 6.0)和1.0 mL氯胺T溶液(0.05 mol/L)后6 min，用过氯酸(3.15 mol/L，1.0 mL)终止反应(静置5 min). 加入100 g/L PDMAB 1.0 mL，于80℃水浴中保温10 min，显色完全后，自来水(25℃)冷却5 min. 最后用7210分光光度计在560 nm波长比色，测量其吸光度A值，用下式计算Hyp含量：肺组织Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A样/A标)／m. 其中，A样为样品管吸光度，A标为标准管吸光度，m为肺重.
1.2.4氧化损伤指标的测定剪取左肺，称质量，按1∶5加入生理盐水制备匀浆. 3000 r/min离心10 min，取上清，冻存备用. 分别以八木国夫荧光法［5］测定肺组织脂质过氧化产物（MDA）；改良盐酸羟胺法［6］测定组织总SOD的酶活力；改良荧光法［7］测定还原型谷胱甘肽（GSH）；荧光法［7］测定氧化型谷胱甘肽(GSSG). 并计算GSH/GSSG值.
统计学处理：数据均以x±s表示. 采用SPSS 11.0统计软件包进行分析，采用成组t检验，方差不齐时用t′检验. P<0.05为有显著性差异.A: Control groupHE ×100; B: BLM groupHE ×100; C: Control groupMasson ×100; D: BLM groupMasson ×100.
2结果
2.1大体形态观察对照组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好. 模型组3 d未见有明显改变，而7 d见双肺有点状出血、灶状瘀斑. 14 d双肺色泽暗淡，局部见大小不等结节样改变，仍有陈旧出血点. 28 d双肺呈灰白色，硬度增加，体积缩小. 表面有条索样凹沟.
2.2光镜观察对照组各观察点均未出现明显病变. 模型组3 d时出现炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变；7 d时肺泡间隔增厚，大量炎性细胞浸润，成纤维细胞开始增多；14 d时肺泡炎仍较重，纤维组织进一步增加；28 d炎症较前减轻，肺纤维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据(Fig 1).
2.3肺脏Hyp含量（Fig 2）模型组Hyp含量于7 d时高于对照组，28 d达到最高（P<0.05）.
2.4肺组织匀浆MDA含量、SOD活力、GSH/GSSG比值变化（Tab 1~3）各指标在不同时间点出现变化. 模型组MDA含量随时间延长而增加，其中14 d时显著高于对照组（P<0.05），但在28 d时有下降. SOD活力在7 d和14 d均降低，28 d时上升. 模型组GSH/GSSG在3 d和7 d显著低于对照组（P<0.05），14 d和28 d又回升.表1两组大鼠肺组织匀浆MDA含量变化（略）表2两组大鼠肺组织匀浆SOD活力变化（略）表3两组大鼠肺组织匀浆GSH/GSSG比值变化（略）
3讨论
活性氧（ROS, Reactive oxygen species） 如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质，包括肺纤维化. 在正常的生理条件下，自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制. 然而，当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化抗氧化系统失衡时，组织就会发生不可逆性损伤［8］. 博莱霉素与铁离子反应可以产生ROS从而损伤蛋白、脂质和DNA，其诱导的肺纤维化包括两个阶段. 早期的炎症阶段，大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润到间质或肺泡中［9］. 在随后发生的纤维化阶段，炎症细胞转移到肺部后，因被激活释放过量的氧自由基，除直接引起肺组织的脂质过氧化，启动PF前的炎症反应，尚可能通过激活核因子κB(NFκB)上调细胞因子的产量，间接促进纤维化的形成［10］；同时，肺纤维化的动物模型或患者中抗自由基的保护系统功能也有所降低. 据此，提出抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基系统的策略.
本实验应用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，观察发现7 d时肺泡炎明显，28 d形成纤维化，且模型组28 d时羟脯氨酸含量显著高于对照组（P<0.05）. 主要病变与指标都与文献一致，说明动物模型复制成功. Hyp是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的13%,其他除弹性蛋白含有少量Hyp(约1%)外，均不含Hyp. 因此组织中Hyp含量可作为其胶原组织代谢的重要指标［11］. 本研究还发现作为体内脂质过氧化指标的MDA 14 d时与对照相比较显著增高（P<0.05），而GSH/GSSG比值在3 d和7 d时有显著降低，其他时间组未见明显变化. 对照组、模型组总SOD活力在7 d和14 d时都有所降低. 以上结果提示，肺组织氧化与抗氧化指标在不同时间点出现不同的变化，作为细胞内最丰富的抗氧化剂，GSH在细胞清除ROS过程中发挥关键作用，尤其在肺纤维化早期炎症阶段大量耗竭；MDA含量和SOD活力在纤维化阶段有所变化，推测在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中，SOD可能发挥一定抑制作用. 而据文献报道，胞外SOD是肺组织的主要抗氧化剂，它分布于细胞表面及胞外基质中，对于保护肺泡细胞及抑制基质的过度重建有重要作用［11］. 因此，研究如何调控细胞基质细胞间氧化/抗氧化系统的平衡等肺纤维化的发生机制，为防治肺纤维化的发生、发展提供新的思路.
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