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研究外界条件的改变对红花离体培养的影响
摘要：目的研究外界培养条件的变化对红花离体培养过程中不同发育阶段培养物的影响。方法以红花种子诱导的无菌苗子叶为外植体，分别接种至含有不同碳氮源、不同PH值、不同温度、不同湿度和不同光照的培养基中，观察其生长情况。结果通过实验筛选出蔗糖浓度为3%，KNO3浓度为MS培养基中KNO3浓度的2倍，最佳pH为6.2，红花离体培养体系在24℃，30%的相对湿度，16 h光照，8 h黑暗交替培养的条件下，最利于红花的分化。结论3%的蔗糖作为碳源，最适合愈伤组织的生长;2倍于MS培养基中的KNO3含量有利于愈伤组织的生长和不定芽的分化;pH值为6.2时，最适宜红花不同阶段培养物的生长;24℃为红花离体培养的最适温度，生根时的温度为21℃较好;湿度为50%时，适于愈伤组织鲜重积累，30%的湿度适于不定芽分化和生根;黑暗培养利于鲜重积累，16 h光照，8 h黑暗交替培养有利于不定芽的分化，8 h光照，16 h黑暗交替培养有利于生根。
关键词： 红花愈伤组织; 不定芽; 蔗糖 ; 氮源; pH值; 温度; 湿度; 光照
红花为菊科一年或二年生双子叶草本植物，喜温暖、干燥气候，抗寒性强，耐盐碱。红花全身是宝，花、籽粒、茎叶、秸秆等均可综合利用，是一种集药材、油料、染料为一体的特种经济作物[1]。由于红花无性快繁体系很难建立，并且目前国内对红花离体培养的研究很少，因此本文通过改变不同的培养条件来研究红花无性快繁体系的建立，以期有利于红花的资源保护、扩大繁殖和进一步推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料红花种子由新疆塔城种子公司提供; 实验以采收后1年后的红花种子不同日龄无菌苗子叶作为外植体。
1.2 方法红花种子，经70%酒精清洗30 s， 0.1 %升汞表面灭菌10 min, 无菌水洗4～5次，接种到种子萌发培养基: 1/2MS 1.5%蔗糖 1 mg·L-1GA中，取接种7日龄的红花无菌苗子叶作为外植体, 分别接种至含有不同碳氮源、不同pH值、不同温度、不同湿度和不同光照的愈伤组织诱导培养基和中;培养一段时间后，测定愈伤组织的鲜重增长量。
子叶完全愈伤化以后，将其转入不同pH值的分化培养基中，诱导不定芽的产生。设置不同的温度梯度和不同光照强度的条件，培养25 d后，观察不定芽的形成情况，观察分化情况，待不定芽形成以后，将其移至生根培养基中，每20 d继代1次，观察生根情况。
2 结果
2.1 碳源在红花愈伤组织生长过程中的作用碳源既是重要的能源物质，也是一种重要的渗透压调节物质，对植物离体形态发生起着非常重要的作用。而碳源的主要提供形式是糖类物质，其中以蔗糖最为普遍，蔗糖是植物体内糖类运输的主要形式，也是某些植物贮藏的主要化合物。有研究认为，蔗糖的浓度对于组织培养很重要，适当的浓度对于维持培养基渗透势，提高植物组培再生频率具有重要意义。因此，本实验探讨了不同的蔗糖浓度在红花脱分化过程中起的作用，分别取1%～7%的蔗糖添加到培养基中，结果见图1，以红花愈伤组织鲜重增长量计算，培养基中加入的蔗糖含量在1%～3%范围内，鲜重增长量呈上升状态，蔗糖含量在3%～7%范围内，红花愈伤组织的鲜重增长量呈下降趋势，蔗糖含量在3%时，愈伤组织鲜重增长量出现峰值，达到6.8 g，蔗糖含量低于3%时，在培养初期，鲜重增长迅速，培养后期，鲜重增长缓慢，以致收获时，生物积累量不高，蔗糖含量高于3%时，鲜重增长量明显下降，说明蔗糖含量过高，不利于细胞生物量的积累。
图1 碳源对红花愈伤组织生长的影响
2.2 氮源对红花愈伤组织生长的影响培养基成分影响植物离体形态发生的效果，在植物组织培养过程中，KNO3和NH4NO3是两个重要的氮素来源，其含量高低可影响愈伤组织生长、离体形态发生，且不同植物、不同的离体培养时期对KNO3和NH4NO3的需求亦不同。在红花愈伤组织培养基中添加了不同浓度的KNO3和NH4NO3，观察二者对红花愈伤组织、不定芽和生根情况的影响。由表1可知，NO-3和NH4 均有利于细胞生长，当MS培养基中去除NH4NO3，仅加入KNO3时，细胞生长缓慢，不定芽分化率极低，但分化出的不定芽伸长略有伸长;当MS培养基中仅加入NH4NO3，去除KNO3时，细胞生长极其缓慢，对不定芽的分化及生根没有促进作用;在MS培养基中加入2倍KNO3时，细胞生长快速，比正常高出4.6%，不定芽分化效果较好，对不定芽伸长起到明显的促进作用，生根情况与正常接近;在MS培养基中加入2倍NH4NO3时，细胞生长一般，比正常低出6.2%，不定芽分化效果与正常MS接近，对不定芽伸长起抑制作用，生根情况与正常MS接近。因此说明，①细胞生长量的积累和不定芽的分化、伸长所需的氮源均不是单一形式的，既需要硝态氮又需要氨态氮，只有二者配合使用才能达到理想效果;② KNO3的含量加倍有利于细胞生长量的积累，同时还利于红花不定芽的分化，对不定芽的伸长起到明显的促进作用;③NH4NO3的含量加倍，对不定芽的伸长起到抑制作用。表1 氮源对红花愈伤组织生长的影响“-”表示无 ; “ ”表示生长缓慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.3 红花培养物在不同酸碱性培养基中的生长情况基质初始pH 值是植物组织和细胞培养的主要影响因子，它直接影响培养物的生长、分化和物质积累。基质最适初始pH值一般为5.0～6.0，但因植物培养的不同种类、不同部位及不同生理状态而异。本实验将培养基的pH值设置5个梯度，分别为5.4，5.8，6.0，6.5，7.0观察其对红花培养物的影响。结果见表2，pH值的变化对愈伤组织的鲜重、不定芽的分化和生根均有一定影响。在一定范围内，鲜重增长量随pH值的上升而上升，pH值为6.2时，达到峰值，之后又随之下降。当培养基偏酸性即pH值为5.4时，不定芽的分化率低，叶片为浅绿色、水分含量高;pH值为6.2时，不定芽分化数量相对较多，且叶片颜色深绿，水分含量少，抗逆性强;当培养基为中性即pH值为7.0时，不定芽分化极少，可能是由于中性环境的培养基过硬，不利于生长调节物质在胞内的运输，以致愈伤组织难以吸收养分，难以分化形成不定芽。
2.4 温度对红花培养物的影响红花分为春播和复播，春播红花适宜期在4月上旬; 春播红花在5月份处于出苗、分枝期,温度较适宜。复播在6月左右，复播红花7、8月处于苗期和花期生长阶段, 出苗期间气温偏高，出苗速度加快，花期是红花开花授精、籽粒开始形成的关键时期，故生长期间需要有较好的光热及水肥条件,要求日平均气温保持在25～27℃。本实验将培养物分别置于18℃，21℃，24℃，27℃，30℃下培养，比较不同温度对培养物的培养效果，结果见表3，24℃是愈伤组织培养的最佳温度，24～27℃形成的不定芽状态都较好，但21℃生根效果较好。这证明了较高的气温利于出苗。表2 pH值对红花生长的影响“-”表示无 ; “ ”表示生长缓慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.5 湿度对红花培养物的影响红花有强大的直根(根深达213 c
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