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小研壳聚糖-明胶三维支架的研究?气道平滑肌细胞培养
1 前言
在组织工程中，三维多孔支架为种植的细胞提供生物力学的支持，使细胞形成功能性的组织[1,2]。报告显示，除了基底的化学性质，支架的结构体系对组织的培养起着重要作用。
近年来，多孔支架的构建和发展在组织工程中的多种应用受到了广泛的关注[3-6]。
胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，属于不溶性纤维蛋白质，遍布于体内各种器官和组织，如皮肤、骨、软骨、肌腱、角膜等等。明胶（Gelatin. Gel），是胶原的部分变性衍生物，无抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲壳素是一种天然高分子化合物，属于多糖。壳聚糖（Chitosan, CS）, 是甲壳素的脱乙酰化产物，是细胞外基质中糖胺聚糖结构类似物。壳聚糖是一种具有优良生物相容性的可降解材料，其在哺乳动物体内能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以进入糖胺聚糖和糖蛋白的代谢循环，也可以排除体外。它还具有低抗原性、促进伤口愈合，抗菌等特性。此外壳聚糖是带正电荷的线性多糖，它可与带负电的生物大分子，如明胶形成聚电解质配合物。壳聚糖还具有较好的力学性能，而且易于加工成型。综合明胶和壳聚糖的优点，将壳聚糖和明胶复合制备多孔支架材料, 将能满足对支架材料的要求[8-10]。
目前，气管组织工程研究的方法是在体外的支架材料上培养气道平滑肌细胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的组织。本实验研究在不同条件下制备壳聚糖-明胶三维支架的结构和性质，以及平滑肌细胞在支架中生长的状态，为筛选可作为气道组织工程研究用的材料奠定基础。
2 材料和方法明
明 胶（ Sigma Chemical Co. ） ； 壳聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析纯,成都科龙化工试剂)；醋酸（分析纯，成都科龙化工试剂）；DMEM/F-12 培养基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培养用三蒸水；细胞培养瓶及培养板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制备三维壳聚糖-明胶支架
实验选用的壳聚糖为精制壳聚糖。称取一定量的壳聚糖用1wt%的醋酸，在室温下溶解，然后在加入明胶（壳聚糖、明胶质量按1：1 比例），使明胶、壳聚糖充分混合溶解，配制成浓度为1、2、3wt%的混合溶液。将混合溶液分装到培养板，然后分别放入不同温度（-20℃，-80℃，-196℃）下预冻。预冻24 小时后，放入冷冻干燥机冻干24 小时。然后对材料进行（用0.25%戊二醛）交联处理，用硼氢化钠脱醛，用蒸馏水洗净后，二次冻干，将材料放入干燥器备用。
2.2 结构观察
用扫描电子显微镜（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）对支架的架构进行观察。在使用SEM 观察支架之前，先用液氮冷冻支架的表面和部分使之断裂,然后喷涂上金。支架孔的平均直径作为支架的有效孔径。随机选择每个样品的三个不同区域，至少选择20 个孔测量孔径。
2.3 孔隙度的测量
我们采用液体转化法来测量三维支架的孔隙度[11,12]。壳聚糖、明胶均不溶于正己烷，因此选用正己烷为转换剂。正己烷能渗透进入相互关联的支架孔中，所产生的膨胀和皱褶可以忽略不计。测量时，首先将支架浸入装有正己烷的量筒中5 分钟，原正己烷的体积记为（V1）。
支架浸入量筒后，原正己烷和支架的总体积记为（V2）。取出支架后，剩余的正己烷体积记为（V3）。支架的孔隙度ε 可以通过以下公式获得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠气道平滑肌细胞的培养
本实验采用组织贴块法来制备大鼠气道平滑肌原代细胞[14]。然后对原代细胞进行传代，使用第3 代的平滑肌细胞。所用培养基为DMEM/F-12 和10%胎牛血清。将细胞培养在37℃，5%CO2 的条件下，每三天换一次液。当细胞爬满培养瓶的80-90%时，可用于实验。
2.5 细胞在壳聚糖-明胶三维支架中的增殖
将原代培养大鼠气道平滑肌细胞的第3 代，稀释到细胞浓度为2×104 个/ml。在装有三维支架的24 孔板中，每孔加入含有气道平滑肌细胞的培养基500μl。培养到1、3、6d 分别用MTT 法检验细胞的活性。每孔加入100μlMTT（5mg/ml），在37℃，5%CO2 的培养箱中培养4h。吸去孔内上清液，每孔加入500μl 二甲基亚砜（DMSO）溶解转化的染料。再从每孔取出100μl 溶液转移到96 孔板，用酶标仪测定490nm 处溶液的OD 值[15]。
2.6 免疫荧光染色
将细胞种植于三维支架材料上以后，选择适当的时间，对细胞骨架进行染色。实验步骤：
吸弃培养板中的培养液；用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2 次，每次10 分钟；4%的多聚甲醛固定20 分钟，用PBS 清洗细胞2 次；0.1%Triton X-100/PBS 室温破膜5 分钟，PBS 清洗细胞3 次；加入5ug/ml 的FITC-Phalloidin 室温染色40 分钟，避光过夜；用PBS 清洗细胞2 次；吸去多余水分，加荧光封片液（中性或偏碱性缓冲液加等量甘油）封片，用荧光显微镜(莱卡,CTR,6000)观察[16,17]。
2.7 统计学方法
所有实验都反复进行4 次，数据用平均值±标准方差表示，n=4。组间数据采用χ2 分析，p<0.01 表示差异有显著统计学意义；p<0.05 表示差异有统计学意义。计算、统计软件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。
3 结果
3.1 预冻温度和材料浓度对支架微结构的影响
本研究制备的壳聚糖-明胶支架采用冷冻干燥法，冷冻干燥是先将物料冻结，然后在接近真空条件下升华逸出溶剂分子的一种干燥方法。该方法既能维持混合物在冻前的外形，又使其具有多孔海绵状结构。冷冻过程中在聚合物网络中形成冰晶模版，在低于冰点的温度下冷冻干燥，冰升华后形成多孔结构。本研究以水作为致孔剂，通过控制冷冻温度可调节冰晶大小，从而控制孔径大小[18]。把壳聚糖-明胶混合材料以不同的浓度和预冻温度制得支架。图1 显示出混合物在预冻温度分别为-20℃、-80℃、-196℃，浓度为1 wt%，2 wt%，3wt%时，形成支架的形态。通过观察，发现当预冻温度为-20℃，混合物浓度为1wt%时，孔径的最大范围是在60-100μm。在相同的预冻温度下，混合物的浓度为2wt%和3wt%，孔径较小，分别为40-80μm 和35-50μm。类似的，我们可以观察到预冻温度越低，所得到的孔径越小(表1)。在不同的预冻温度下，随着支架孔径的大小变化，支架的孔隙度也在发生变化。当支架的预冻温度在-196℃时，其孔隙度高于预冻温度在-20℃和-80℃的支架。
比较不同的预冻温度，最高的孔隙度为93±0.6 %，其预冻温度为-196℃。而同样的预冻温度下，浓度为2wt%和3wt%的支架的孔隙度降为90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的预冻温度下，孔隙度有着同样的变化趋势，而相比于-196℃的预冻温度，孔隙度都降低了，显示出孔隙度取决于材料的预冻温度和浓度。
冻干过程是在冰点以下使材料中冰晶升华，形成与原冰晶同样尺度的孔径。在较低的预冻温度下，由于冷冻速度较快，形成数量较多和体积细小的冰晶，导致冻干材料孔径较小，孔壁较薄，孔隙度较大。在预冻温度较高时，冰晶可以不断生长，形成数量较少和体积较大的晶体，导致冻干材料孔径较大，孔壁较厚，孔隙度较小 [19]。而溶液的浓度直接影响溶液的粘度。当溶液浓度较大即粘度较大时，不利于水和分子链的迁移，以至于形成的冰晶较小。
因此孔径与溶液的浓度成反比[13]。
3.2 细胞在支架中的生长
通过扫描电镜来观察平滑肌细胞在材料上的生长。由图2 可以看出，细胞接种到三维支架上以后，能贴附到支架上，在细胞数较少的情况下，细胞更趋向于沿着孔壁生长。多孔结构的优势在于为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积, 同时有利于营养成分的进入和代谢产物的排出而不致引起细胞的生长抑制作用[20]。培养6 天的时间内，细胞在支架上黏附生长良好，但细胞并未完全伸展。同时细胞没有铺满孔壁，还较少向孔中生长。
3.3 MTT 检测细胞增殖
通过MTT 实验来测试气道平滑肌细胞在材料中的细胞活性。细胞在材料中的生长受到多种因素的影响，包括表面结构、理化性质等。把等量的细胞种植于支架中。由图3 可见，随着时间的增加OD 值也随之增加，说明细胞在材料中生长良好。同时有图3 可以看出，支架的微结构对细胞的增殖情况有一定的影响。实验发现，随着支架孔径以及孔隙度的增大，时间的延长， 细胞的增殖情况良好。而且孔隙度对细胞增殖的影响较为显著（*p<0.01,**p<0.05）, 说明支架的孔径对细胞的增殖起着重要的作用，然而支架的孔隙度在细胞增殖过程中起着更为显著和决定性作用。
3.4 免疫荧光染色
FITC-Phalloidin 可特异的与真核细胞的filamentous actins 结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。通过FITC-Phalloidin 标记细胞的filamentous actins 来观察细胞的生长形态。FITC-Phalloidin 标记细胞的filamentous actins 在荧光显微镜下呈绿色。由图4，可以观察到细胞在材料生长状态良好，细胞呈现出各种形态，有放射状，圆形，条形等。细胞骨架结构清晰。
4 讨论
众所周知，细胞在三维支架中的存活和增殖受到支架的孔径和孔隙度的影响。许多研究表明要在一定范围增强细胞在支架中的存活、增殖，要么增加支架的孔径，要么增加支架的孔隙度，或者同时增加孔径和孔隙度的大小[21,22]。在本研究中，我们认为孔隙度对细胞存活和增殖的影响不同于孔径，孔隙度的改变对细胞在支架中的存活和增殖影响更为明显。采用冷冻干燥法可以成功制备壳聚糖-明胶三维支架，支架的孔隙结构取决于预冻过程中形成冰晶的数量和大小。在构建三维支架时，我们可以通过改变预冻温度和浓度，来调节支架的孔隙度与孔径，从而改变支架的微结构。由此，可以根据需要，来构建合适的壳聚糖-明胶三维支架。同时，发现大鼠气道平滑肌细胞在壳聚糖-明胶三维支架中生长时，支架的相对孔径、孔隙度越大，细胞生长越好。
在组织工程的进程中，发展一种适合细胞生长的材料是很重要的。材料的结构和性质对形成有功能性的组织起着重要的作用。大鼠气道平滑肌细胞在壳聚糖-明胶支架中的良好生长情况，显示出支架的生物相容性和适合细胞生长的特性，壳聚糖-明胶支架显示出了在组织工程领域良好的应用前景。
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