医学检验专业的毕业论文
一段充实而忙碌的大学生活即将结束，我们都知道毕业生要通过最后的毕业论文，毕业论文是一种有准备的检验学生学习成果的形式，那么毕业论文应该怎么写才合适呢？以下是小编为大家收集的医学检验专业的毕业论文，欢迎大家分享。
摘要：基于石墨烯量子点( GQDs) 的荧光性能建立了一种非标记荧光方法，用于灵敏和选择性测定抗坏血酸( AA) .GQDs 溶液在紫外光激发下发出很强的蓝色荧光，当向溶液中加入 AA 后，GQDs 溶液的荧光被猝灭。猝灭机理可能为在弱酸性介质中，AA 与 GQDs 发生氧化还原反应，AA 转移电子给 GQDs.荧光猝灭强度与AA 浓度在 5.0 × 10- 6~ 7.5 × 10- 5mol / L 范围内呈良好的线性关系，检出限低至 1.0 × 10- 6mol / L.该体系成本低、操作简单，并且在多种可能干扰的物质存在下对 AA 表现出很高的选择性。本方法应用于生物样品中AA 的检测，回收率在 95.2% ~ 115.3% 之间。
关键词： 石墨烯量子点; 荧光探针; 非标记方法; 抗坏血酸。
Abstract: A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantumdots ( GQDs) was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid ( AA) .The initialstrong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition ofAA.The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDs via the redox re-action of AA and GQDs in weak acid solution.The quenching efficiency was linearly proportional tothe concentration of AA within the range of 5.0 × 10- 6- 7.5 × 10- 5mol / L with a low detection limitdown to 1.0 × 10- 6mol / L.The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experi-mental operations,and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species.Additionally,this method was successfully applied to the determination of AA in biological sampleswith satisfactory recoveries ( 95.2% - 115.3% ) .
Key words: graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid.
1、引言。
石墨烯量子点( GQDs) 是最近发现的粒径小于 100 nm 具有0 维结构的石墨烯纳米片[1-3].与石墨烯类似，GQDs 也有大的表面积和 π-π 共轭网状结构。作为一种新的碳纳米荧光材料，GQDs由于其优越的光稳定性、优良的光学和电化学性能、高的荧光活性、抗光漂白能力和低细胞毒性[4-8],已经在化学、材料、物理学和生物学领域引起较大关注并成为当前的研究热点之一，目前已用于氯离子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三价铁离子[12]、过氧化氢[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白 G[16]、生物巯基化合物[17-18]、脱氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的检测，以及用于药物释放[21]和生物成像[22-24]等领域。
抗坏血酸( AA) 是一种重要的抗氧化剂，在人体平衡氧化压力中起重要作用。AA 在人体液中存在的浓度相对较高，例如，人血液中 AA 的浓度为 6 ~ 15 μg/mL[25].AA 是治疗坏血病、药物中毒、肝脏疾病、过敏反应和动脉粥样硬化的药物，并能帮助促进健康细胞的发展、钙的吸收和正常组织的生长。在制造果汁和饮料时，AA 也作为一种抗氧化剂使用。因此，AA 的检测对制药、临床和食品工业均具有重要意义[26].目前检测AA 的方法主要有电化学方法[27]、化学发光法[28]、高效液相色谱法[29]、分光光度法[30]、毛细管电泳法[31]和荧光分析法[32]等。电化学方法由于灵敏度高，是检测 AA 的主要方法。但是，与AA 具有相似还原性质的分子如尿酸( UA) 和多巴胺( DA) 对该方法造成的干扰较大，而且 AA 的氧化产物会吸附在电极表面，影响体系的稳定性和重现性。荧光分析法具有简单、方便和快速等优点。因此，本工作以 GQDs 作为荧光探针，建立了基于 GQDs 的荧光猝灭检测 AA 的新方法。
2、实验。
2.1 仪器与试剂。
LS-55 型发光光度计( Perkin-Elmer,USA) ; Cary60 型紫外可见分光光度计( Agilent Technologies,USA) ; PHSJ-4A 型 pH 计( 上海精密科学仪器有限公司) ; XW-80A 型漩涡振荡混合器( 上海医科大学仪器厂) ; TGL-16G-A 型高速冷冻离心机( 上海安亭科学仪器厂) 等; SZCL-3B 数显智能控温磁力搅拌器( 巩义市予华仪器有限责任公司) ;78-1 磁力加热搅拌器( 常州国华电器有限公司) ; BS 110S 电子天平( 北京赛多利斯天平有限公司) ; FL3-P-TCSPC 时间分辨荧光仪( HORIBA JOBIN JVON,France) ; JEM-2100F 场发射透射电子显微镜( JEOL) ; Multimode 8原子力显微镜( Bruker,USA) .
抗坏血酸( AA) 、人血清白蛋白( HSA) 购于美国 Sigma-Aldrich 公司; 多巴胺( DA) 购于 AlfaAesar 公司; D-色氨酸 ( D-Trp) 、DL-苏氨酸 ( DL-Thr) 、L-α-丙氨酸 ( L-α-Ala) 、L-组氨酸 ( L-His) 、D-丝氨酸 ( D-Ser) 、L-赖氨酸 ( L-Lys) 、L-亮氨酸( L-Leu) 、L-苯丙氨酸( L-Phe) 由中国医药( 集团)上海化学试剂公司提供; 尿酸( UA) 购于上海生工生物有限公司; 半乳糖( Gal) 、果糖( Fru) 、甘露糖( Man) 购于比利时 Acros Organics 公司; 柠檬酸购于广州化学试剂厂。
实验所用其他化学试剂均为国产分析纯，实验用水为 18.2 MΩ·cm 的超纯水。
实验所用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液( 1.0 ×10- 2mol / L,pH 4.0 ~ 7.5) : 称取 0.78 g NaH2PO4·2H2O,溶于 450 mL 超纯水中，定容至 500 mL,用H3PO4和 NaOH 溶液调节 pH 值。
2.2 人血清样品的预处理。
人血清样品取自桂林市第五人民医院。取200 μL 人血清，置于 1.5 mL 离心管中，加入 400μL 乙腈，漩涡震荡混合 5 min,在高速冷冻离心机上以 1.2 ×104r / min 的速度离心 20 min,取上层清液，用氮气吹干，残留物用 1 000 μL 超纯水溶解，试液置于冰箱中 4 ℃保存备用。
2.3 GQDs 的合成。
GQDs 的合成方法参照文献[33].称取 2.0g 柠檬酸加入试管中，加热至 200 ℃ ,当柠檬酸全部融化后开始计时。20 min 后，溶液颜色变为橘红色。在磁力搅拌作用下，将橘红色液体用滴管逐滴加入 100 mL 含 10 mg NaOH 的溶液中，用HCl 调节 pH 至 7.0,得到 GQDs 水溶液，浓度为14 mg / mL,于 4 ℃ 下避光保存。
2.4 实验方法。
在一系列0.6 mL 的离心管中，依次加入10 μL1.4 mg / mL GQDs、10 μL 不同浓度的 AA 以及 80 μLpH =4.5 的磷酸盐缓冲液，充分混匀后，在 37 ℃ 下孵育4 h.冷却后，采用 LS-55 型发光光度计( Per-kin-Elmer,USA) 记录样品在 453 nm 处的荧光强度，设置电压为750 V,激发、发射狭缝宽度均为15 nm,扫描速度为1 000 nm/min,激发波长为367 nm.
3、结果与讨论。
3.1 GQDs 的表征。
所合成的. GQDs 的透射电子显微镜和原子力显微镜图像、红外光谱、紫外吸收光谱和荧光光谱均参见文献[34].本实验合成的 GQDs 的粒径为17 ~21nm,平均厚度为 1.5 nm.GQDs 表面存在羧基和羟基，这些官能团赋予了 GQDs 优良的水溶性。GQDs在紫外区有较强的吸收，在 360 nm 处有一吸收峰，并且在 365 nm 紫外灯照射下可观察到蓝色荧光。GQDs 具有对称的激发和发射光谱，其最大激发波长为367 nm,最大发射峰波长为453 nm.
3.2 荧光猝灭机理。
GQDs 的荧光猝灭机理。GQDs本身在激发光照射下发出蓝色荧光。已有研究证明，氧化石墨烯( Graphene oxide,GO) 能被 AA 还原[35].因为本实验合成的 GQDs 表面带有-COOH,与 GO 具有相似的表面基团，因此加入 AA后，AA 与 GQDs 发生氧化还原反应，AA 被氧化为脱氢 抗 坏 血 酸 ( dehydro-AA) 并 转 移 电 子 给GQDs,GQDs 的荧光被猝灭。
3.2.1 紫外吸收光谱。
猝灭机理也可通过紫外光谱来证明。加入 AA 后，GQDs 在 360 nm 处的特征峰消失，说明 GQDs 与 AA 反应生成了其他物质。
3.2.2 荧光寿命。
为了进一步证实 AA 对 GQDs 的猝灭机理，实验测定了体系的荧光寿命是 AA 加入前后 GQDs 的荧光衰减曲线。
表 1 是 GQDs 猝灭前后的荧光寿命值。从表中可以看到，AA 加入前后，体系的荧光寿命发生了明显变化，说明猝灭过程是动态猝灭[36-37].动态猝灭是碰撞过程，因此 AA 猝灭 GQDs 的荧光机理可解释如下：
GQDs + h ν →* GQDs + AA→[* GQDs…AA]( 碰撞复合物 )→GQDs-+ AA+( 还原态的电子转移)[38]
激发态分子* GQDs 遇到AA,两者相互作用导致电子和能量的转移，最终导致* GQDs 的荧光猝灭。
3.3 可行性验证。
为了考察本方案的可行性，我们对 GQDs 与AA 反应前后的样品溶液进行了荧光光谱扫描。AA 加入后，GQDs 在 453 nm 的荧光强度降低，荧光被猝灭了 79.6%,说明该方法能用于 AA 的检测。
3.4 AA 与 GQDs 作用时间的优化。
实验考察了 AA 加入后，GQDs 溶液的荧光强度随时间的变化。见，体系的荧光强度随时间的延长而逐渐下降，在大约4h 以后，荧光强度降低速度减慢，之后荧光强度变化不大。为了保证测定的灵敏度同时缩短分析时间，实验选择4 h 作为 AA 与 GQDs 的作用时间。
3.5 pH 值的优化。
实验以磷酸盐为缓冲液，考察其 pH 值对 AA猝灭 GQDs 荧光的影响，结果。GQDs本身的荧光会受 pH 的影响。当 pH 在 4.0 ~7.5之间时，GQDs 的荧光随 pH 的升高而增强，但体系在 pH =4.5 时有最高的信噪比。因此，实验选择 pH =4.5 的磷酸盐缓冲液作为 AA 与 GQDs 的反应缓冲液。
3.6 线性范围和检出限。
在上述优化的条件下，实验对一系列不同浓度的 AA 进行了检测，实验结果。可以看出，随着 AA 浓度的增大，体系在 453nm 处的荧光强度逐渐降低，并且荧光强度值的比值 F0/ F( F0为 GQDs 的荧光强度，F 为加入 AA之后体系的荧光强度) 与 AA 的浓度在5.0 ×10- 6~7.5 × 10- 5mol / L 范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为 F0/ F = 0.0537C + 0.7467,R =0.997 1( C 为 AA 的浓度，单位 10- 6mol / L) ,检测限( 3σ，σ = S0/ S,S0为空白溶液多次测量的标准偏差，S 为标准曲线的斜率) 为 1.0 ×10- 6mol / L.我们将本方法与其他检测 AA 的方法做了对比，见表 2.从表 2 中可以看出，该方法与其他方法相比具有较高的灵敏度。
为了考察该方法的精密度，实验将 7.5 ×10- 5mol / L AA 与 GQDs 反应进行了 11 次平行测定，得到荧光强度的相对标准偏差 ( RSD) 为3.4% .3.7 特异性考察。
为了考察所建立方法的特异性，实验选用几种糖类以及 HSA、尿素( Urea) 和几种氨基酸作为对照样品进行分析。GQDs 的浓度为 0.14 mg/mL,AA 的浓度为 7.5 × 10- 5mol / L,其他作为干扰物质的浓度均为 7.5 × 10- 5mol / L.实验结果。可以看出，只有 AA 的加入能引起信号的明显变化，其他物质均不存在干扰，特别是 DA、UA 这两种与 AA 有相似电化学性质的物质，也不存在干扰。因为在本实验中，AA 与GQDs 的反应介质为 pH = 4.5 的磷酸盐缓冲液，在这个 pH 值下，DA、UA 均不干扰 AA 的测定。
3.8 实际样品分析。
为了考察本研究所建立的方法是否可用于实际样品的检测，实验对人血清样品进行了分析。从医院取的血清样品按照 2.2 节方法进行处理，在稀释 50 倍后的血清中进行加标实验，实验结果如表 3 所示。从表中可以看到，人血清中 AA 的加标回收率在 95.2% ~115.3%范围内。
4、结论。
建立了一种基于 GQDs 荧光猝灭检测 AA的新方法，该方法操作简便，灵敏度高，检出限低至 1.0 ×10- 6mol / L,特异性强，一些糖类和氨基酸的存在均不干扰 AA 的测定，甚至是与 AA有相似电化学性质的 DA、UA 的存在对 AA 的检测也没有影响。本实验用到的所有原料都价廉易得且不需要任何修饰过程，GQDs 相对于其他量子点的合成更简单而且具有低毒性，有望应用于生物体内生物活性物质的检测。
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