三叶青的毒理学研究
关键字： 毒理学三叶青为葡萄科植物三叶崖爬滕Tetrastigma hems-leyanum Diels et Gilg的根 ［1］ ，又名金线吊葫芦、石老鼠。在浙江民间素有食用习俗，为评价其安全性。我们按《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中“食品安全性毒理学评价试验”进行实验 ［2］ ，现将结果报告如下。
1 样品
三叶青块根，切片，10倍水浸泡2h，每次1h，收集煎液。浓缩成1g生药/ml浓度，由杭州天惠医药科技有限公司提供。按民间食用习惯15g/人/d计算。
2 实验动物和检测条件
实验用ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供，清洁级，医学实验动物合格证号为2001001，医学实验动物设施合格证号为2001001。实验用SD大鼠由浙江省实验动物中心提供，清洁级:医学实验动物合格证号为2001001，医学实验动物设施合格证号为2001001。实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，执行标准GB14925-2001。检测环境条件:温度范围20℃～25℃，相对湿度范围60%～70%。实验动物试验前在动物房环境中适应3天，染毒前禁食过夜，不限制饮水。
3 实验方法
3.1 大鼠急性经口毒性试验
3.1.1 实验动物 选用健康、成熟、体重180～220g SD大鼠20只，雌雄各半。
3.1.2 剂量和给药方法 按最大耐受量试验方法将大鼠分为10.0g/kg，体重剂量组，每组20只，雌雄各半。大鼠灌胃前停食16h。连续观察14天，并记录动物中毒症状及死亡情况。
3.1.3 观察指标 染毒后，观察大鼠的一般状况、中毒症状和死亡情况，观察期限2周。
3.2 小鼠急性经口毒性试验
3.2.1 实验动物 选用健康、成熟、休重18～22g ICR小鼠20只，雌雄各半。
3.2.2 剂量和给药方法 按最大耐受量试验方法将小鼠分为40.0g/kg体重剂量组，每组20只，雌雄各半。小鼠灌胃前停食16h。连续观察14天，并记录动物中毒症状及死亡情况。
3.2.3 观察指标 染毒后，观察小鼠的一般状况、中毒症状和死亡情况，观察期限两周。3.3 Ames试验
3.3.1 试验菌株 选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌，共四株，即TA 97a 、TA 98 、TA 100 、TA 102 。由上海劳动卫生职业病研究所提供，经生物学鉴定合格后进行试验。
3.3.2 剂量选择及阳性对照物 试验采用平板掺入法。样品以蒸馏水稀释至相应剂量。用TA 100 菌株的'非代谢活化系统进行预试验，结果在剂量为5000μg/皿时未出现明显的增菌和抑菌现象，故正式试验时选择试验浓度为8、40、200、1000、5000μg/皿5个剂量组，外加阴性对照（蒸馏水，DMSO）和阳性对照组（9-氨基吖啶、2，7-二氨基芴、叠氮钠、2-乙酰氨基芴、丝裂霉素C、1，8-二羟基蒽醌），每种菌株每个测试浓度设三皿平行，在加和不加S 9 条件下进行试验。 3.3.3 观察指标 直接计数培养基上各菌株的回菌落数。
3.4 小鼠骨髓细胞微核试验
3.4.1 实验动物 实验用ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供，体重25～28g。
3.4.2 剂量和给药方法 小鼠随机分5.0、10.0、20.0g/kg体重三个剂量组，一个阴性对照组（灌胃等容量蒸馏水）和一个阳性对照组（丝裂霉素C2.0mg/kg体重），每组10只。样品以灌胃方式给予，连续5天，每天1次，对照组也相同处理。于首次灌胃后第35天脱臼处死，每组随机选5只小鼠分别取两侧附睾，制成吸滤液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，用1%伊红染色。
3.5 观察指标 高倍镜下观察精子形态并计数，每只小鼠计数完整精子1000条，计算精子畸形发生率（%）。
4 实验结果
4.1 大鼠急性经口毒性试验 实验期间，各组大鼠均未见明显症状，也无死亡。三叶青对雌雄大鼠经口LD50均大于100g/kg体重，属实际无毒。
4.2 小鼠急性经口毒性试验 实验期间，各组小鼠均未见明显症状，也无死亡。三叶青对雌雄大鼠经口LD50均大于40.0g/kg体重，属实际无毒。
4.3 Ames试验 各菌株回变菌落数见表1。表1 三叶青Ames平扳掺入试验结果（略）从实验结果可见，不同浓度受试物在加和不加S 9 条件下的回变菌落与阴性对照组相近似，而阳性对照回变菌落数均高于阴性对照回变菌落数2倍以上。说明三叶青 Ames试验检测结果为阴性。
4.4 小鼠骨髓细胞微核试验 三叶青对小鼠骨髓细胞微核率的影响见表2。表2 三叶青对小鼠骨髓细胞微核率的影响（略）注: * P<0.01（与阴性对照组比较）
用卡方检验统计，雌雄各剂量组与阴性对照组比较，微核千分率均无显著性差异，而阳性对照组微核率则显著高于阴性对照组，其差异有显著性（P<0.01）。说明三叶青 对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显影响。
4.5 小鼠精子畸形试验 三叶青对小鼠精子畸形发生率的影响见表3。表3 三叶青对小鼠精子畸形发生率的影响（略）注: * P<0.01（与阴性对照组比较）各剂量组与阴性对照组比较，小鼠精子畸形发生率均无显著性差异，而阳性对照组则明显高于阴性对照组，其差异有显著性意义（P<0.01）。说明三叶青对小鼠精子畸形发生率未见明显影响。
5 结论
三叶青按《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版） 中“食品安全性毒理学评价试验:第一阶段大鼠经口急性毒性半数致死LD50），雌雄两性别均大于100g/kg体重:小鼠经口急性毒性半数致死量（LD50），雌雄两性别均大于40.0g/kg体重，按急性毒性分级标准判定，属实际无毒;第二阶段Ames试验结果为阴性，小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均为阴性，说明三叶青未显示有致突变性。