外周血PSA、PSA mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用
作者：辛华 马雷 高英英 郭宇航 孙玉鸿 江清林 刘国辉【摘要】 目的 探讨利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测诊断前列腺癌（PCa）的临床应用及意义。方法 运用酶联免疫分析和巢式RT?PCR检测22例PCa、10例良性前列腺增生（BPH）患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情况。结果 PCa患者血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关（P＜0?05），而与年龄无关（P＞0?05）；外周血PSA、PSA mRNA与临床分期、内分泌治疗有关（P＜0?05），而与年龄、Gleason评分无关（P＜0?05）；22例PCa标本中PSA mRNA阳性表达15例，阳性率68%，10例BPH和10例阴性对照标本无表达。结论 利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测是一种早期发现PCa微转移，判断其临床变化过程、分期、预计复发和评价疗效的方法。
【关键词】 前列腺特异抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆转录聚合酶链式反应
临床上大约有50%的前列腺癌(PCa)病人在确诊时就已经发生了转移,病变已属晚期，预后不良〔1～3〕。国外报道血清游离PSA与外周血PSA mRNA联合检测PCa在鉴别良、恶疾病上有一定优越性〔4，5〕。国内这方面报道较少。应用RT?PCR技术检测外周血中存在的少量癌细胞，可以发现微转移，对肿瘤的复发、转移、预后及临床治疗具有指导意义〔6，7〕。本研究采用酶联免疫技术和巢式RT?PCR技术联合检测外周血PSA和PSA mRNA，以提高PCa微转移的诊断效率、监测复发、预测肿瘤分期及预后。
1 材料与方法
1?1 病例资料
PCa组：选择2005～2006年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院门诊和住院病人。22例均为初诊PCa患者，均经前列腺穿刺病理诊断，年龄64～82岁，平均72岁。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗，7例未接受。BPH组：10例均为行前列腺经尿道电切术后病理证实患者，年龄34～81岁，平均65岁。阴性对照组：5例男性健康志愿者（检测前1个月限制性生活）和5例女性健康志愿者，血液学指标均正常，年龄25～45岁，平均38岁。
1?2 仪器及材料
Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院天津血液病研究所，总RNA提取RNAiso试剂盒、两步法RT?PCR试剂盒购自大连生物工程有限公司，引物由上海生物工程服务技术有限公司合成，PSA定量试剂盒购自美国博检生物试剂有限公司。Biometra Tg PCR 仪：华粤企业集团有限公司；DU800核酸蛋白分析仪：Beckman公司；免疫分析仪器：DNM9602G型酶标分析仪（北京普朗仪器公司）。
1?3 引物序列
PCR引物：（1）外引物：PSA?494：5’?TACCCACTGCATCAGGAACA?3’；PSA?960：5’?CCTTGAAGCACACCATTACA?3’。（2）内引物：PSA?559：5’?ACACAGGCCAGGTATTTCAG?3’；PSA?894：5’?GTCCAGCGTCCAGCACACAG?3’。β?actin 上游：5’?CGGGAAATCGTGCGTGACAT?3’；下游：5’?GAACTTTGGGGGATGCTCGC?3’。扩增目的'片段长度为712 bp。
1?4 血清的提取
抽取空腹静脉血（各项检查前）5 ml，立即2 000 r/min离心10 min，分离血清置-20℃保存，1 w内完成实验。
1?5 外周血单个核细胞的提取
抽取5 ml静脉血（各项检查前）肝素抗凝，用Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞置-80℃冰箱保存，提取过程按其说明书操作。
1?6 总RNA的抽提及质量鉴定
用Trizal试剂提取总RNA，提取过程按其说明书操作。提取产物用1?2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。紫外分光光度计下测OD260、OD280，测定RNA纯度和浓度。取OD260/OD280值在1?8～2?0范围内的标本进行逆转录。所有实验中的塑料制品及实验用具均经0?1轕C水处理后高压灭菌。
1?7 RT?PCR
取1 μg总RNA进行逆转录反应；取逆转录产物2 μl和PSA上下游外、内引物各1 μl，使用20 μl反应体系进行2次PCR（2次PCR反应体系相同），同时扩增PSA、β?actin和阴性对照cDNA（由健康女性外周血白细胞RNA逆转录获得）。具体循环参数为：94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；25个循环之后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用EB染色，经凝胶成像系统拍照。