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hTERT基因启动子调控HSV
作者：卞卡，张惠中，任继鸿，赵辉，成诗银【关键词】 端粒,末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因
【Abstract】 AIM: To observe the killing effect of HSVtk/GCV system on cervical carcinoma cells under the control of hTERT(human telomerase reverse transcriptase) core promoter. METHODS: An eukaryotic expression vector containing HSVtk gene under the control of hTERT core promoter was constructed and was transfected into cervical carcinoma cells(HeLa) and vessel endothelial cells(ECV304) by liposome method. Transfected cells were then selected with G418 and RTPCR was used to detect the tk gene expression in HeLa cells and ECV304 cells. After GCV was added, flow cytometry method were applied to investigate its cell killing effect. RESULTS: pCIneo/hTERTtk/GCV system under the control of hTERT induced the apoptosis in more than 36.7% of cervical carcinoma cells, but not in normal vessel endothelial cells. CONCLUSION: hTERT gene core promoter is tumorspecific and may be useful in tk gene therapy of cervical carcinoma and in reducing the side effects of the therapy.
【Keywords】 telomerase; promoter regions (genetics); cervix neoplasms; tk gene
【摘要】目的： 研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法： 构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞（ECV304），新霉素（G418）筛选阳性克隆扩增. 用RTPCR法比较两种细胞tk基因的表达情况；给予前药更昔洛韦（GCV），用流式细胞术检测hTERT调控的HSVtk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果： hTERT启动子调控下的HSVtk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用，使36.7%的细胞凋亡；而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论： hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法，有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.
【关键词】 端粒，末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因
0引言
宫颈癌是死亡率较高的恶性肿瘤,传统治疗方法以手术、化疗、放疗为主,但晚期不宜手术者及对放化疗不敏感者5 a生存率仍不理想. 随着分子生物学及相关技术的迅速发展,自杀基因疗法在肿瘤治疗中取得了一定疗效，其利用人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（human simplex virusthymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV）将更昔洛韦（ganciclovir, GCV）等前药磷酸化为细胞毒产物,从而阻止细胞DNA合成, 杀伤肿瘤细胞［1-2］. 有研究发现，由于缺乏特异性，tk基因修饰的正常组织细胞经前药治疗后会与肿瘤细胞一起被杀死，造成对正常组织的杀伤. hTERT基因在90%的人类肿瘤组织中呈过表达［3］，具有明显的肿瘤特异性.我们采用克隆hTERT基因启动子，利用其在肿瘤细胞中特有的启动活性来控制HSVtk的肿瘤特异性表达的方法，旨在实现其在肿瘤细胞中的特异性杀伤作用.
1材料和方法
1.1材料Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶以及电泳中所用marker DL2000和DGL2000均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自日本Promega公司；质粒提取、纯化试剂盒购自北京天为时代公司；转染试剂盒LipofectamineTM2000购自美国Introvigen公司；含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因与tk基因的pGL3 Basic质粒由第四军医大学唐都医院耳鼻喉科韩明鲲馈赠；pCIneo质粒由第四军医大学唐都医院肾内科杨洁馈赠；GCV购自广东丽珠集团；大肠杆菌菌株JM109，宫颈癌细胞HeLa和脐静脉内皮细胞ECV304均由第四军医大学唐都医院临床实验科提供；流式细胞仪美国Coulter公
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