瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究
目的 观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法 采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果 瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.43±0.12),差异有非常显著意义(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论 瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均有着积极作用。Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedinHSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionInHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2 sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion.
【Keywords】HypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression
增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的［1］，近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响［2-5］，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的.价值［6］。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活性功能中的作用。
1 材料与方法
1.1 组织标本
增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄17～40岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间均在6～9个月之间。
1.2 主要试剂及物品准备
羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DMEM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。
1.3 成纤维细胞培养
手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。
1.4 CRT免疫细胞化学染色
体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。
1.5 CRT原位ELISA检测［7］
选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板内。培养16h