碱度对硫酸盐还原效率及微生物群落动态的影响
引言
高浓度有机废水的处理多采用厌氧技术，但是当废水中含有高浓度硫酸盐时，会给废水处理带来很大困难，即由于硫酸盐还原过程的介入，使厌氧降解过程出现了产甲烷菌(MPB)与硫酸盐还原菌(SRB)之间对底物的竞争以及硫酸盐还原产物对MPB 和SRB 毒性抑制等问题[1]。基于此，应用两相厌氧工艺中的产酸相对硫酸盐进行预去除的策略得到广泛认同。
碳硫比、硫氮比、硫酸盐负荷、水力停留时间和碳源种类等环境因子都能够影响产酸硫酸盐还原效率，国内外学者对这些生态因子在硫酸盐还原过程中的作用也进行了较为深入的探讨[2,3]。然而，碱度作为直接影响系统pH，从而保持系统稳定性的关键环境生态因子，却很少有研究报道。在硫酸盐还原过程中，碱度可以及时缓冲产酸菌产生的挥发酸(VFA)，并降低CO2 的产生和溶解对pH 值的影响，维持体系所需pH 值。硫酸盐还原体系中与酸碱平衡有关的共轭酸碱对主要有：H2CO3/HCO3-，HCO3-/CO32-，H2S/HS-，HS-/S2-，HAc/Ac-等。随着反应体系pH 值的不同，这些共轭酸碱对在各种形态间的分布也会发生变化[4]。
本研究应用厌氧折流板反应器(ABR)，探讨调节进水碱度过程中，硫酸盐还原效率的变化情况，同时应用分子生物学方法解析微生物群落对碱度变化的响应，研究结果可为SRB生态学理论提供有益补充，也可为硫酸盐废水处理工艺的改进和革新提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验采用厌氧折流板反应器，装置分为五个格室，总体积24 L，有效容积21 L。模拟废水成分中COD 为4000 mg/L(乳酸和/或乙酸)，SO42-为2000 mg/L，另加少量(NH4)2HPO4以补充氮磷，pH 7.0~7.5，水力停留时间(HRT) 24 h，运行温度35±1℃。根据进水碱度不同，试验分为五个阶段，第一阶段为反应器启动阶段，不调节进水碱度，进水碱度约为500 mg/L，历时46 d；第二阶段进水碱度通过投加NaHCO3 调节至1000 mg/L 左右，历时32 d；第三个阶段为从第79 d 至124 d，将进水碱度提升到2000 mg/L；第四阶段是从第125 d 至135 d，又将碱度降到1000 mg/L；最后一阶段是从第136 d 开始，将碱度提高至2000 mg/L。反应器运行过程中，根据文献[4]的方法，对进出水中的VFA、硫酸盐浓度、碱度和pH 值、硫化物浓度及氧化还原电位(ORP)进行检测。
1.2 微生物群落分析
定期于反应器第3 格室中部吸取活性污泥，采用土壤DNA 提取试剂盒(Mobio，USA)提取微生物总DNA 。PCR 扩增采用细菌16S rRNA 基因通用引物BA341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和BA534R (5’-ATTACCGCGGCTGCTGG -3’)， 引物BA534R 5’端带有40 bp GC 夹，根据文献[5]对PCR 产物进行DGGE 分析。
DGGE 图谱数字化后，对DGGE 图谱中各泳道微生物进行Shannon-Weiner 多样性指数(H′)分析，H′通过公式H′=?ΣPi lnPi 计算，其中Pi 是泳道中条带的相对信号强度；采用SPSS软件(SPSS Inc.，Chicago IL)以Ward’s 方法对各泳道群落进行聚类分析，并与反应器运行状态相结合，解析群落变化与反应器功能的关系。
DGGE 图中条带按文献[5]方法回收并克隆测序。序列通过RDP中的Seq Match 程序进行分类，然后以Blast 在线工具检索最相近序列。
2 结果与讨论
2.1 碱度变化对硫酸盐去除效率的影响
试验中的碱度主要为NaHCO3 碱度，可缓冲体系pH 值的变化，从而维持体系相对稳定，并为功能微生物提供良好的生存环境，提高硫酸盐去除率。从可见，在ABR 运行的第一阶段，进水中未加NaHCO3 调节碱度，进水碱度很低的情况下，出水pH 为6.5 左右，但波动很大。由文献[2]可知，当系统内pH 维持在6.0 左右时，反应体系主要是Ac-(挥发酸，以Ac-表示)碱度，体系对于酸的缓冲能力减弱，反应器呈现酸化的趋势。
由可见，反应器在前46 d 内进水碱度维持在500 mg/L 左右，体系的去除率在40%，而且波动较大。从第47 d 开始，加入NaHCO3 进行调节进水碱度，使其维持在1000 mg/L，其去除率逐渐提高至75%，此时，出水pH 上升至7.0 以上，且出水碱度也随之升高至2500mg/L。NaHCO3 为强碱弱酸盐，当体系中H+增加时，HCO3-可以与其反应，缓冲pH 变化。
从第78 d 开始，将进水碱度调整为2000 mg/L，硫酸盐的去除率提高到90%。文献表明[6]，在反应器启动初期，当不调节进水碱度时，进水在产酸菌的作用下，产生大量酸性末端产物，导致pH 值下降，在低pH 下，硫化物易生成H2S，由于中性的H2S 更容易进入细胞体内，故能够抑制甚至杀死SRB。所以在启动期，SRB 对H2S 的毒性耐受力较差，最终将导致SRB生长和繁殖能力降低，硫酸盐去除率下降。而在高pH 下，体系中主要以HS-形式存在，降低了对SRB 的毒性，从而使硫酸盐的去除率有所提高。
SRB 获取能量的主要途径主要是硫酸盐异化还原过程，该过程须在较低的氧化还原电位下才能进行，文献[6]指出，要维持硫酸盐去除率在80%以上，ORP 必须低于-320 mV。ORP受系统内pH 值的直接影响，从可以看出，当系统内pH 在6.2~6.8 之间时，ORP 维持在-320 mV 左右；当投加碱度后，系统出水pH 值逐步上升，系统内ORP 不断降低，最终维持在-420 mV 左右。可见，pH 值与ORP 呈负相关。
在反应器的启动期，进水的碱度大约为500 mg/L，末端产物为乙酸和丙酸。当碱度提高为1000 mg/L 时，液相末端产物组分中乙酸占据绝对优势，挥发酸总量上升到3500 mg/L。当碱度继续提高到2000 mg/L 时，液相末端产物总量降低，乙酸含量降低至1500 mg/L，但依然占据主导地位。此时VFA 降低，可能是在反应器后几个格室中，逐步形成了产甲烷环境，产甲烷菌利用了前几格室产生的VFA，从而使VFA 总量减少。可见在低碱度下运行时，反应器产酸发酵能力会逐步降低，而碱度提高能增强反应器产酸功能，并影响着发酵类型。
2.2 碱度调节对微生物群落结构的影响
微生物群落的变化对反应器的去除效率有很大影响。分别在反应器运行的不同时期(第0 d，10 d，18 d，29 d，36 d，43 d，53 d，63 d，77 d，85 d，103 d，111 d，120 d，136 d)获取泥样，得到微生物群落DGGE 图谱及其聚类分析(图未给)。对DGGE 图谱中的主要条带进行克隆测序分析，结果如所示。
根据DGGE 图谱及其聚类结果，每个阶段内的微生物群落间的相似性较高，而相邻阶段间的微生物群落表现出逐渐过渡的群落演替趋势。
在第一次提高进水碱度至1000 mg/L 后(53 d)，微生物群落多样性有所增加，Shannon-Weiner 多样性指数由2.91 上升至3.16，条带A8, A9 和A10 得以富集。测序表明它们分别与Desulfomicrobium baculatum, Candidatus ubique 和Desulfomicrobium macestii 相似性较高。Candidatus ubique 在硫酸盐废水处理中不常见，这说明提高进水碱度改变了反应器内原有环境，使得微生物多样性得以提高。
对DGGE 图谱中各群落(泳道)进行Shannon- Weiner 多样性分析可以定量描述不同阶段微生物种类及数量。多样性指数(H′)可以评价一个微生物群落内物种的丰富性以及微生物数量的多少。由可以看出，反应器运行第一阶段，即前50 d，微生物多样性指数为2.62~2.94，说明在该阶段微生物的物种比较丰富，反应器运行良好，可以支撑更多种类的微生物生存。在反应器运行46 d 以后，DNA 条带有明显变化，微生物多样性指数提高至3 以上，表明微生物多样性增加，可能是由于进水中碱度的增加使原来未处于优势种群的菌落，得以迅速生长繁殖，进而提高了生物多样性。在第三阶段，当碱度提高至2000 mg/L 时，生物多样性指数变化不大。
2.3 特异类群对进水碱度变化的响应
由可见，发现常驻种群条带(A1, A2, A3 和A4)在反应器的启动和运行过程中仅数量上有些变化，当碱度剧烈变化时，这些条带波动幅度较小。测序表明它们分别与Alkaliflexusimshenetskii, Thauera terpenica, Sulfuricurvum kujiense 和Desulfomicrobium norvegicum 等菌株相似性较大。这些菌均为厌氧微生物，存在于各种厌氧环境中，部分种属能够利用广泛的底物发酵产酸。根据文献[7]，在硫酸盐代谢过程中，反应器中微生物可分为两大类群，即产酸菌和SRB。产酸菌负责将大分子底物（蔗糖/果糖等）分解为SRB 可利用的底物乙酸，乙醇，氢气，甲醇，甲酸等，可见这些常驻菌群对硫酸盐还原过程具有重要意义，通过产酸菌和SRB 的种间协作，形成良好的底物食物链关系，维持微生物代谢的较佳环境。
第一阶段初期生物多样样性比较丰富，但随着反应器的运行，生物多样性指数呈降低趋势，部分微生物条带逐渐消亡，如条带A6 和A7，这可能与革兰氏阴性菌对碱度较为敏感有关[6]。而条带A10 和A13 所指示的种群开始富集。
第二阶段碱度提高至1000 mg/L 的过程中，Veillonella sp. S101, Acinetobacter soli,Desulfomicrobium baculatum, Spirochaeta sp. Buddy 得以富集；继而提高至2000 mg/L 时，Desulfomicrobium macestii 得以富集， 同时Veillonella sp. S101, Acinetobacter soli,Desulfomicrobium baculatum 和Spirochaeta sp. Buddy 所指示的条带浓度继续加强。
Desulfomicrobium baculatum 和Desulfomicrobium macestii 为不完全氧化型SRB[8]，主要利用乙醇和H2 为电子供体还原硫酸盐，生长环境酸碱度范围较宽，最适宜范围为pH6.0~6.5，是该反应器中硫酸盐去除率的主要贡献者。
3 结论
进水碱度变化会明显影响硫酸盐的去除率。在没有加入NaHCO3 调节碱度的情况下，反应器的去除率为45%左右，当碱度提高至2000 mg/L 后，去除率提高到90%。
低碱度下，反应器内的产酸菌代谢产物降低了系统的pH 值，抑制了某些菌种的生长代谢，如Veillonella sp. S101 和Acinetobacter soli。在硫酸盐还原过程中，一些常住菌如Alkaliflexus imshenetskii, Thauera terpenica, Sulfuricurvum kujiense 和Desulfomicrobiumnorvegicum 等发挥重要的作用。
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