细胞培养中的微生物污染及防控对策的论文
细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。体外细胞污染可分为3类： 物理性、化学性、生物性污染[1].其中生物性污染常见且造成的后果也较为严重，培养的细胞一旦遭到微生物污染，将具有不可逆转性，轻则污染细胞废弃，重则连带污染培养箱内的其他细胞，甚至整个实验室的环境，给科研工作带来严重的损失和威胁。以下对细胞培养过程中常见的微生物污染及防控作以介绍。
1 细菌污染
细菌污染特点为污染速度快，易被发现。细菌污染后，培养基1 ~ 2 d就会变浑浊，对细胞生长影响明显[2],p H值改变[3].常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等（ 革兰阴性菌） 葡萄球菌等（ 革兰阳性菌）[4-5],其中革兰阳性菌较为多见[6],利用此特点可指导抗生素的应用。污染主要来源实验室环境、实验人员（ 实验服）、实验用具等[4].污染后的镜下特点为： 胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动[5].
疑细菌污染后，可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类； 有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物 的 培 养 液 接 种，也 可 取10 m L细 胞 悬 液 以100 rpm离心5 min,沉淀中加入无抗生素的培养液2 m L,置于37 ℃培养，24 h可得结果。确定污染后，若想进行挽救可在细菌污染培养液中添加双抗（ 青链霉素）、西司他丁钠+亚胺培南消除细菌污染[4,7].
2 霉菌污染
霉菌污染特点为短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物。污染的主要来源为实验人员（ 实验服）[5].污染后的镜下特点为： 低倍镜下可见乳白色的团状漂浮物，培养液无变化； 高倍镜下可见明显的.菌丝，细胞活力变差，生长速度明显变慢，甚至死亡[8].
疑有霉菌污染的细胞可离心后经PAS染色进行霉菌镜检，同时进行霉菌培养以确定污染及鉴定霉菌种类[9].霉菌污染初期，在培养液中可见漂浮的菌丝，这时将污染的细胞培养液慢慢吸出，用Hanks液清洗细胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培养液，即青霉素100单位/m L,链霉素100单位/m L,两性霉素10 mg /L,24 h后观察换液，若仍有菌丝可重复上述步骤进行处理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但经此种方式处理后对细胞的生长影响也较大。另有报道低速离心法可清除霉菌污染，方式简单对细胞影响小[9].但建议一般出现霉菌污染，如果不是非常珍贵的细胞一般都是扔掉，而且连相关的容器都要做严格的处理。
3 支原体污染
支原体污染的特点为短期无变化，具有隐蔽性。它们可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常的感觉。如果继续使用这种已被支原体污染而貌似正常的细胞做试验或生产，将会严重影响结果[1].污染的主要来源为血清[4].污染后镜下特点： 在光镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡[10].
目前实验室检查支原体污染的金标准为DNA荧光染色法结合直接培养法[11],主要辅助检测方法有PCR法、显 微镜法等[12-16],其他方法有滚环扩增技术[17]、瓜氨酸测定法[18]、免疫荧光抗体法、放射自显影法[19]等。相对于其他污染的检测，支原体污染的检测方法虽多，但在价格及特异性方面差异很大，应根据实验需要及实验条件进行选择。支原体的清除一般不宜用抗生素，因其对抗生素不敏感，主要的清除方法有抗血清处理法、高温处理法、小鼠腹腔巨噬细胞清除法、选择性杀灭哺乳动物类细胞培养物中支原体的方法，其中小鼠腹腔巨噬细胞清除法效果较好，方法是将支原体污染的细胞注射到小鼠腹腔。经24 h或48 h后，将小鼠腹水抽出（ 腹水已含注入的细胞） ,经离心后收集细胞于培养瓶内培养[19].因在日常细胞培养过程中支原体的污染常被忽视，为了避免损失可 定 期 对 实 验 室 中 的 培 养 物 进 行 支 原 体 检测[20].
4 病毒污染
病毒污染特点是极为隐蔽，很难用常规的方法检测到[21].受病毒污染的细胞液通常清亮无变化。污染分为外源性和内源性[19,22],污染的主要来源为细胞系，常见于杂交瘤细胞[4].大多数受病毒污染的细胞不会产生形态变化及细胞病理现象[19],少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落[21].
疑病毒污染后，可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒[19].通常病毒物污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。
5 黑胶虫污染
黑蛟虫是一种生物还是非生物，学术界还有争论。其污染特点为开始对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响[23].受黑蛟虫污染的细胞液通常清亮无变化。污染主要来源于血清，400倍显微镜下可见点状或片状游动小体。
黑蛟虫早期污染一般采用如下方法： 用0. 25%的胰酶消化，当有少量细胞变圆或脱壁时，用血清终止消化，轻轻用培养基或D-Hanks液清洗3遍（ 缓慢流过细胞表面） ,不要吹打，然后吹散细胞，换培养瓶培养，隔天换液。2 d后重复一次，以后每24 ~ 36 h换1次液，1周后，黑点可基本消失。也可用麦诺霉素10 mg /L处理，连续1周，但麦诺霉素对细胞有毒性[23].
6 细胞的交叉污染
细胞的交叉污染一般来自细胞建株和细胞传代过程中两种或两种以上细胞之间的污染[19].镜下可发现细胞的形态发生改变，与正常该细胞株的形态不同。
关于细胞系的种系来源可以通过各种免疫学试验、同功酶分析及细胞遗传学方法来确定。其中以荧光抗体染色法和同功酶谱系分析法应用较广泛。同功酶分析法不仅可以鉴别细胞种属，而且可以鉴别种内细胞的交叉污染[19].若发生细胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放弃细胞。为避免细胞的交叉污染，在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时发生混乱。在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞[23].
7 结 语
细胞一旦发生污染，任何一种挽救细胞的处理可能都会对细胞产生不良或未知的影响，因此如果不是不易获得的细胞，实验者都应该抱着严谨平和的态度重新开始。细胞培养中污染的来源主要有以下几种途径：1） 细胞组织本身带有污染；2） 实验室内空气不洁净；3） 实验操作者未能严格遵守操作规程；4） 生物安全柜不洁净或使用不正确；5） 实验中所用的器具和培养基消毒不彻底。因此实验者应从以上几方面尽量避免细胞污染，才能保证实验的有序进行。
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