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拟Smac作用下膀胱癌T24 细胞增殖及凋亡的研究
引言
Smac/DIABLO 蛋白（线粒体促凋亡蛋白）自被发现以来，经过几年的研究已经成为细胞凋亡研究中的一个热点。近年来，国内外很多学者将其应用于泌尿系统肿瘤研究和治疗，并认为Smac/DIABLO及由它衍生而来的小分子多肽及其类似物将为未来泌尿系统肿瘤的治疗开辟一个新领域[1]。纳米技术作为近年来出现的高技术新兴科学，由于其表现出现的各种特性，有利于医学及其各个分支的研究，特别是对肿瘤的早期诊断和治疗有着显着的意义。
本文将二者相互联系，通过合成的拟Smac 多肽磁性纳米粒作用于膀胱癌T24 细胞，探讨其对膀胱癌T24 细胞的增殖及凋亡的影响2. 材料与方法2.1 试剂拟 Smac 合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期实验制备合成。MTT 溶液、Hoechst33258 染色试剂盒购自武汉凌飞生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin单克隆抗体购自美国cellsignal 公司。RPMI1640 培养基及胎牛血清购自美国GIBCO 公司。
其他常用生化试剂购自美国Sigma 公司。
2.2 细胞培养与实验分组实验
设正常对照组（A）、单纯SmacN7-O-CMC-MNPS 组（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组（C）。膀胱癌T24 细胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640 培养基培养于5%CO2的37℃培养箱中，待细胞生长至对数期时用无血清1640 洗涤2 次，每孔滴加0.5μmol/L 的SmacN7-O-CMC-MNPS，C 组磁场为8mT。转染4h 后加入含胎牛血清的1640 培养基继续培养。
2.3 MTT 检测细胞增殖参照 MTT 试剂盒使用说明。
以细胞密度约104/孔接种于96 孔板，按照上述实验分组，每组设置4 个复孔，每孔100ul，按照不同分组加入药物，继续培养24h、48h、72h 后采用MTT 法检测细胞增殖活性，绘制细胞增殖率变化曲线，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖率=实验组A490nm/正常对照组A490nm×100%，（A 为吸光度值）细胞增殖抑制率=（1-细胞增殖率）×100%。
2.4 Hoechst33258 检测细胞凋亡将各实验组
按照上述实验方法处理24h 后，用0.25%胰酶+0.02%的EDTA 消化细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度约为107 /ml,取细胞悬液100ul，加5ul Hoechst33258 染液（100ug/ml）细胞悬液中，充分混匀后滴于载玻片上，盖片封片后在荧光显微镜下观察细胞形态并摄影。
2.5 实时荧光定量PCR（Realtime RT-PCR）检测
P53,Bax,Bcl-2 mRNA 的表达采用 TRIZOL 试剂两步法提取各实验组细胞的总RNA，运用逆转绿试剂盒合成cDNA.使用primer5.0 设计Bax、Bcl-2、β-actin 引物。反应体系20ul：cDNA 0.8ul、上游引物0.8 ul、下游引物0.8ul、SYBR Green Mix 10ul、DEPC H2O 7.6ul.扩增条件：94℃ 预变性5min，94℃ 30S， x℃(不同基因退火温度不同)15S, 72℃15S,共计40 个循环，72°延伸10min，每0.2℃读板一次，绘制扩增曲线及溶解曲线，收集数据。
2.6 蛋白免疫印迹（Western-Blot）检测
Bax,Bcl-2 蛋白的表达收集各实验组细胞，用BCA 试剂盒对蛋白样品定量。取等量蛋白20ug 上样于10%的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），以120mV 恒压电泳1h，200mA 恒流转膜50min，膜于含5%脱脂奶粉的TBST20ml 封闭液室温封闭30min，加一抗(1:1000)4℃过夜，次日TBST 洗膜10min×3 次，加用封闭液稀释的HRP 标记的二抗（1：7500）室温1h，TBST 洗膜10min×3次，加ECL 发光，X 胶片曝光，洗片，收集数据。
2.7 统计学分析所有数据
均以x ± s表示，采用SPSS15.0统计软件处理，不同处理组间差异采用ANOVA或 Dunnett T-test，P<0.05 为差异有统计学意义。
3. 结果3.1 SmacN7-O-CMC-MNPS 联合磁场
能显着抑制膀胱癌T24 细胞增殖及诱导凋亡和对照组相比，SmacN7-O-CMC-MNPS转染膀胱癌T24 细胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组均不同程度地出现肿瘤细胞生长抑制和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒外加磁场对T24 细胞的生长抑制作用和诱导凋亡作用更明显。
3.2 SmacN7-O-CMC-MNPS
联合磁场对膀胱癌T24 细胞凋亡相关基因的mRNA及蛋白表达的影响在外磁场条件下，SmacN7-O-CMC-MNPS 转染膀胱癌T24 细胞24h、48h、72h 后采用Realtime RT-PCR 及Western blot 检测，结果可见Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表达随着作用时间的延长而逐渐降低。相反，Bax 的表达量则逐渐升高，且此效应比不加磁场的SmacN7-O-CMC-MNPS 转染膀胱癌T24 细胞的作用更明显，这说明外磁场条件下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒能透过膀胱癌T24 细胞细胞膜，通过干扰凋亡信号传导通路诱导细胞的凋亡。
4. 讨论Smac/DIABLO 在胞浆中合成最初的前体蛋白
含239 个氨基酸，分子量为27KD，SmacmRNA 全长1.5Kb。全长的Smac/DIABLO 蛋白没有任何活性，必须在线粒体内进行信号肽的切除后才能获得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO 参与细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路的下游反应，通过竞争性地结合凋亡抑制蛋白IAPs 解除对caspase 的阻遏而促进凋亡的发生。Smac/DIABLO 蛋白衍生的含AVPI 四肽结构的小分子多肽也具有重要的抗肿瘤效果。研究表明，Smac/DIABLO 小肽与载体蛋白结合并转染细胞后可以使体内和体外化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡效果明显增加。Smac/DIABLO 蛋白通过干扰凋亡信号转导通路，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其过度增殖。
多肽合成技术的突破性进步，使多肽类药物显示出优于传统药物的治疗效果，但由于其具有难以透过生物膜屏障且不稳定、易降解变性等特点限制了它的临床应用。如果将靶向药物进行适当修饰就可能起到保护药物，提高药物的稳定性，促进药物的吸收利用，进而产生良好的生物学效果。磁性纳米颗粒可以作为多肽、激素、单克隆抗体、基因等物质的载体，也可以携带药物；同时它具有超顺磁特性，即在磁场中有较强的磁性，没有磁场时磁性很快会消失，从而不会被永久磁化；而且纳米级Fe3O4 能够排出体外，在外加磁场的作用下可以使得其作为载体复合物所携带的药物作定向移动，从而实现靶向治疗。
Smac 是一种新型的线粒体促凋亡蛋白，其N 端的AVPI 四肽发挥着重要的促凋亡作用。本实验通过合成拟Smac 多肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物，在外加磁场下作用于膀胱癌T24 细胞，实验数据显示，外加磁场的诱导下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒能发挥拟Smac 合成肽的抑制肿瘤细胞增殖及促凋亡作用，且外加磁场作用更为明显。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性纳米颗粒是通过调控凋亡相关基因Bcl-2，Bax 来影响肿瘤细胞的活性。
综上，本实验首次将人工合成促凋亡多肽制成磁性纳米颗粒SmacN7-O-CMC-MNPS 在外加磁场下作用于膀胱癌细胞，显着抑制了肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，为膀胱肿瘤的体内磁导向靶向治疗提供了有力的实验保障。
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