研究海带多糖体外抗氧化作用
摘要： 目的 研究海带多糖体外抗氧化作用。方法 采用体外实验研究海带多糖对羟自由基、超氧阴离子的清除作用以及对 H2O2 诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保护作用。结果 海带多糖体外可清除O-2· 及 ·OH; 抑制 H2O2 诱导的大鼠红细胞氧化性溶血; 抑制小鼠组织MDA的生成。结论 海带多糖体外具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用。
关键词： 海带多糖;氧自由基;脂质过氧化;抗氧化
海带属海带目海带科，含有多种生物活性成分，其大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关[1]。海带多糖(laminarin)是从海带中提取出来的多糖类化合物。梁桂林[2]等对海带多糖进行体内抗氧化研究，结果表明海带多糖在体内具有抗氧化活性。本文对海带多糖的体外抗氧化作用进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
海带多糖的提取、纯化及纸层析鉴定法按文献[3]制备。将市售干海带适度粉碎,用蒸馏水浸泡,加热提取,冷却离心,浓缩,浓缩液加入4 倍体积的 95% 乙醇沉淀,沉淀物依次用无水乙醇、丙酮及乙醚洗涤,用蒸馏水复溶,透析,Seveg 法除蛋白,常规干燥得海带多糖。纸层析分析表明,海带多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖等组成。硫酸-苯酚法测多糖含量为 85%，考马司亮蓝法测定总蛋白含量。
硫代巴比妥酸购自国药集团化学试剂有限公司(批号：20080925);肝素为万邦医药(批号：0812111);抗坏血酸为福州海王福药制药有限公司产品(批号：0901042);硫酸亚铁、过氧化氢、三氯乙酸等均为市售分析纯试剂。
752N紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);TDL?60B台式离心机 (上海安亭科学仪器厂);BS124S分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) ;HH?S数显恒温水浴锅(常州市国立试验设备研究所) ;XH?C旋涡混合器(常州市国立试验设备研究所)。
实验动物为昆明种清洁级小鼠10只，体质量18～22 g，雌雄各半，由福州海王福药制药有限公司提供，许可证号：SCXK(闽)2005?0003。
1.2 方法
1.2.1 海带多糖清除·OH 效果的测定 根据Smirnoff 等的方法改进[4]，用FeSO4 H2O2 产生·OH，以·OH 氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH 的多少，吸光值越大，·OH 越多。 4 mL 反应体系中含9 mmol/ L FeSO4 1 mL ，8.8 mmol/ L H2O2 1 mL ，9 mmol/ L水杨酸1 mL(用50%乙醇作溶剂)及1 mL 不同浓度的海带多糖，最后加H2O2 启动反应，37 ℃温浴1 h，于 510 nm 测吸光值。空白组以重蒸水代替水杨酸和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。清除率以[A0-(Ai-Ai0)]/ A0 × 100% 计算，其中 A0 为对照，Ai 为海带多糖某浓度时的吸光值，Ai0为空白组的吸光值。
1.2.2 海带多糖清除O-2 效果的测定[5] 每支试管加Tris?HCl缓冲液 (pH 8.2) 4.5 mL ，25 ℃ 预热 20 min ，加1 mL 不同浓度的海带多糖，再加10 mmol/ L 的邻苯三酚 0.4 mL ，立即摇匀，准确反应4 min ，立即加入8 mol/ L HCl 0.1 mL终止反应，325 nm 测吸光值。空白组以重蒸水代替邻苯三酚和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。清除率以(A0-Ai)/(A0-Ai0)× 100%计算，其中A0为对照，Ai为海带多糖某浓度时的吸光值，Ai0为空白组的吸光值。
1.2.3 海带多糖对小鼠红细胞H2O2 所致溶血的影响[6] 小鼠颈总动脉采血，肝素抗凝，4 ℃ 3 000×g离心得红细胞，冷生理盐水洗 3 次，制成0.5% 悬浮液。取红细胞悬液 1 mL ,加不同浓度的海带多糖，最后加50 mmol/ L H2O2 0.5 mL混匀，37 ℃ 温浴1 h，加生理盐水 4 mL，3 000 r/min 离心5 min，取上清于415 nm测定其吸光值。正常组以生理盐水代替H2O2和海带多糖，模型组以生理盐水代替海带多糖。以模型组为100 %溶血，计算溶血度及抑制率。
1.2.4 海带多糖对生成 MDA 抑制作用的测定 小鼠颈椎脱臼致死，迅速分离出肝组织和心组织，用冷的生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成含蛋白质0.5%的悬浮液。
取5% 肝/心匀浆悬浮液0.2 mL，加入不同浓度海带多糖溶液1 mL，在37 ℃温浴1 h 后，加入20% TCA 1 mL 终止反应,再加0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中显色15 min，冷却后离心，测532 nm上清液吸光度，以吸光度表示MDA 含量的多少。对照组以重蒸水代替海带多糖，清除率以(A0-Ai)/A0 × 100% 计算，其中为A0为对照，Ai为海带多糖某浓度时的吸光值。
1.2.5 海带多糖对Fe2 ?H2O2 诱导的小鼠肝线粒体中MDA生成的影响 肝组织于在冰浴下以生理盐水制成10 %匀浆，2 000 r/ min 离心20 min，取上清液，以10 000 ×g 离心 20 min,沉淀用生理盐水洗涤 2 次后,以生理盐水配成吸光值在 0.5～0.6 的线粒体悬浮液[7]。取肝线粒体悬浮液 2.5 mL，加入不同浓度海带多糖 溶液0.4 mL，再加入1 mmol/ L FeSO4 0.1 mL，1 mmol/ L H2O2 0.1 mL，在37 ℃温浴1 h 后，取0. 1 mL 温育后的各管溶液，加入20 % TCA 1 mL 终止反应，再加0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中显色15 min，冷却后离心，于532 nm 测上清液吸光值。对照组以重蒸水代替海带多糖，清除率如“1.2.4”计算。
1.3 统计学处理
实验结果以(±s)表示，进行组间t检验，以P
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