探讨楮实提取物的体外抗氧化活性
摘要： 目的 探讨楮实提取物的体外抗氧化活性。方法 先用80%乙醇，然后用蒸馏水对楮实进行提取。其中醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分经醇沉、干燥后得到楮实粗多糖。运用羟基（·OH）自由基体系、二苯代苦味基肼（DPPH·）自由基体系和对Fe3 的还原能力实验，比较楮实各提取物的抗氧化活性。结果 楮实提取物对·OH自由基和DPPH·自由基均有较好的清除作用，其中总醇提取物对·OH自由基的清除能力最强，其IC50值为0.28 mg/ml；乙酸乙酯提取物对DPPH·自由基的清除效果最好，其IC50值达到0.08 mg/ml；各提取物对Fe3 均有较强的还原能力，乙酸乙酯提取物还原效果最为明显。结论 楮实提取物具有一定的抗氧化活性，在抗衰老方面有广泛的应用前景。
关键词： 楮实；抗氧化活性；清除自由基；还原力
楮实子具有活血理气、补肾清肝、明目、利尿的功效，多用于腰膝酸软、虚劳骨蒸、头晕目眩、目生翳膜、水肿胀满等症。一些含楮实子的'经典方药经多年临床验证具有确切的抗衰老、促智作用。机体内氧化自由基增加是导致衰老的主要原因，清除自由基可起到延年益寿的作用。近年来研究发现楮实子油及楮实子黄酮成分有显著的抗氧化和清除及抑制氧自由基作用；楮实子红色素能显著清除超氧阴离子及羟基(·OH)自由基，抑制H2O2诱导小鼠红细胞溶血和肝匀浆自氧化，对肝线粒体也有保护作用。但目前还未见到对楮实聚花果进行抗氧化活性评价的报道。本实验运用水杨酸法、二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)法、Fe3 还原能力的方法对楮实不同极性溶剂提取物体外抗氧化能力进行评价，为楮实更广泛地应用于医药和开发新型保健品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
药材于2009年7月采自贵州省贵阳市药用植物园，经贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为构树〔Broussonetia papyrifera(L.)Vent.〕的成熟果实。DPPH·(百灵威公司)；抗坏血酸（Vc）、无水乙醇、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰h钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氟乙酸均为国产分析纯试剂，乙醇为食用级。
1.2 仪器与设备
HP?8453型紫外可见分光光度计(惠普公司)；JA2003精密电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；DK?98?11电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.3 提取与制备
楮实干燥粉碎，80%乙醇回流提取5次，每次回流2 h，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，得楮实总醇提物。取适量醇提物用水混悬后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩至固体，真空干燥后得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水层部分，作为待测样品置于干燥器中保存。
将乙醇浸提后的药材残渣在室温下挥去乙醇，加入蒸馏水，沸水浴提取5次，每次2 h。合并水提液减压浓缩至一定体积，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最终浓度≥80%，沉淀真空干燥后即为楮实水提粗多糖，作为待测样品置干燥器中保存备用。
1.4 抗氧化活性测定
1.4.1 清除·OH自由基
采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2 混合产生·OH自由基，在该体系中加入水杨酸捕捉·OH自由基并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。取各萃取物50 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg用蒸馏水溶解，定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度。依次加入样品4 ml，9 mmol/L FeSO4 0.5 ml，9 mmol/L水杨酸0.5 ml，8.8 mmol/L H2O2 0.5 ml。该体系于37℃水浴中加热30 min，于510 nm处测定样品吸光度（Ai）。用4 ml蒸馏水代替体系中的样品，测定得空白吸光度（A0）。向体系中加入蒸馏水0.5 ml代替8.8 mmol/L H2O2，测定样品本底吸光度（Aj）。每个质量浓度样品做3个平行，取其平均值，以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=〔A0-(Ai-Aj)〕/A0×100。
1.4.2 清除DPPH·自由基
DPPH·自由基是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm波长有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除，使得在该波长下吸收减弱，可借此来评价物质的抗氧化活性。取各萃取物50 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg，用蒸馏水溶解并定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度；以无水乙醇配制0.16 mmol/L DPPH·溶液，避光保存。取3 ml待测样品溶液加入3 ml DPPH·溶液于25℃水浴中加热15 min，在517 nm测得试样吸光度（Ai）。取3 ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0）。向3 ml样品中加入3 ml蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），每个质量浓度样品做3个平行，取平均值。以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=〔A0-(Ai-Aj)〕/A0×100。
1.4.3 Fe3 还原能力测定
取2.5 ml不同质量浓度的样品乙醇溶液，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液2.5 ml及1%铁氰h钾2.5 ml，50℃水浴反应20 min后急速冷却，加入10%三氟乙酸溶液2.5 ml混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml，加入4 ml蒸馏水及0.1% FeCl3 1 ml，10 min后于700 nm处测定吸光值。以Vc作为阳性对照。
2 结 果
2.1 对·OH自由基的清除作用
由图1可以看出，大部分提取物对·OH自由基都表现出一定程度的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显的量效关系，但各部分提取物的清除能力都弱于Vc。清除能力大小依次为总醇提取物＞氯仿提取物＞正丁醇提取物＞粗多糖＞水层＞乙酸乙酯提取物。考虑到样品本底吸收的影响，本实验样品最高浓度为1 mg/ml，未测定更高浓度样品的清除作用。石油醚提取部分效果不明显，故未对其进行比较分析。
楮实提取物对·OH自由基清除活性的半清除率浓度（IC50，mg/ml）值顺序为：Vc(0.06)＜总醇提取物(0.28)＜氯仿提取物(0.31)＜正丁醇提取物(0.41)＜粗多糖(0.74)＜水层部分(1.01)＜乙酸乙酯提取物（12.44）。半清除率浓度与清除能力大小成负相关，即半清除率浓度越小则清除能力越强，除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的半清除率浓度随着提取溶剂极性增大而
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