膝骨痹康袋泡熏洗剂提取工艺的优化
【摘 要】目的：优选用于膝骨关节炎的膝骨痹康袋泡熏洗剂的提取工艺。方法：采用L9(34)的正交试验法，利用高效液相色谱法和紫外分光光度法分别测定柚皮苷和乌头碱的含量，并以干膏得率、柚皮苷含量和乌头碱含量的加权综合评分作为工艺筛选的评价指标，考察膝骨痹康袋泡熏洗剂制剂的水提取加水量、煎煮时间和提取次数对提取工艺的影响，确定膝骨痹康袋泡熏洗剂的最优提取工艺。结果：膝骨痹康袋泡熏洗剂最优提取工艺为15倍加水量，煎煮3次，每次1 h，验证3批所得样品平均的干膏得率、柚皮苷含量和乌头碱含量分别为20.73%、102.5 mg、22.4 mg，与正交试验结果相符，达到优化效果。结论：优选的提取工艺简便、稳定、重复性好，可用于膝骨痹康袋泡熏洗剂的工业化生产，为该制剂的进一步研究奠定良好的基础。
【关键词】 骨关节炎，膝;袋泡熏洗剂;提取工艺;正交优化
膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)属中医学“膝骨痹”范畴，是一种以关节软骨退变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，多见于中老年人，女性多于男性。KOA的发生发展是一种长期、慢性、渐进的病理过程，对早、中期患者治疗在于控制关节疼痛、延缓或阻断残疾进展、恢复关节活动功能[1-3]。
作为传统中药外治法之一的熏洗法，具有理疗和中药的双重治疗作用，同时通过经皮给药可以避免肝脏的首关效应及胃肠道影响，医患均易于控制给药并维持稳定而持久的药物浓度，在治疗KOA方面取得良好的效果[4-6]。但熏洗过程中需要患者自行煎煮药汤，较为费时、繁琐，极大地降低了患者依从性。膝骨痹康袋泡熏洗剂由骨碎补、制川乌、艾绒、红花等药材组成，具有祛风湿、止痹痛、通经络、强筋骨之功效，是临床外用熏洗治疗KOA的经验方，适用于肝肾气血虚损、风寒湿瘀痹阻为基本病机的KOA患者，对缓解疼痛、肿胀、关节功能障碍等疗效确切。
本研究拟将其改为袋泡熏洗剂，以君药骨碎补中的药效成分柚皮苷以及臣药川乌中的乌头碱为指标，通过L9(34)正交试验，开展袋泡熏洗剂提取工艺的优化试验，为该制剂的新药研制奠定基础。
1 试验材料
1.1 试验仪器 双光束紫外可见分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司);数显恒温水浴锅(HH-6，国华电器有限公司);高效液相色谱仪(LC-20A，SPD-M20A PDA检测器，LC-20AT四元梯度泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司);色谱柱(Diamonsil C18 5 u 250 mm×4.6 mm);万分之一电子分析天平(FA604A，上海精天电子仪器有限公司);超声波清洗器(KQ-400E，昆山市超声仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240，上海精宏试验设备有限公司)。 1.2 试验药材 研究所需药材购于福建百晟药业有限公司。槲寄生(产地河北，批号1406005);骨碎补(产地江西，批号1408005);续断(产地湖北，批号1407007);伸筋草(产地江西，批号1405005);透骨草(产地湖南，批号1404004);海桐皮(产地贵州，批号1403003);艾绒(产地安徽，批号20140506);制川乌(产地四川，批号131101);制草乌(产地山西，批号131015);白芷(产地安徽，批号20140618);威灵仙(产地辽宁，批号1404004);川芎(产地四川，批号20140408);川椒(产地四川，批号140301);红花(产地新疆，批号20140418)。
1.3 试验试剂 研究所需乌头碱对照品(0720-9807)购于中国食品药品检定研究院，柚皮苷对照品(110722-201312)购于中国药品生物制品检定研究院。甲醇为色谱纯，三氯甲烷、冰醋酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计 前期预试验以水为溶媒，对复方药材进行水提，并以柚皮苷及干浸膏得率的综合评分为指标，发现加水量、煎煮时间、煎煮次数对结果有明显影响。根据预试验并参考文献[7]，本研究对加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)进行正交试验考查，各因素拟定3个水平，见表1。以加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素为考察对象，以干浸膏得率、柚皮苷含量、乌头碱含量的综合评分作为确定最佳提取工艺的衡量指标，选用L9(34)正交试验表进行试验，见表2。其中D列为自动生成的误差列，筛选最佳的提取工艺。柚皮苷(Ⅰ)和乌头碱(Ⅱ)为复方中代表性的有效成分，选择其作为评价指标之一，权重系数各定为0.4，而作为有效成分煎出间接控制的一个指标，药效物质提取的多少可以从干膏得率(Ⅲ)的大小来判断，权重系数定为0.2，进行综合评价，筛选最佳工艺。准确称取除红花外的复方药材9份，每份158 g，按L9(34)正交试验所示条件提取，滤过，合并提取液，将其水浴蒸发浓缩，烘箱减压干燥，得干浸膏作为各供试样品备用。综合评分=(Ⅰ/Ⅰmax×0.4 + Ⅱ/Ⅱmax×0.4 + Ⅲ/Ⅲmax×0.2)×100。
2.2 指标测定
2.2.1 干浸膏得率的测定 提取液浓缩后置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱中减压干燥至恒重，称重。计算干浸膏得率，干浸膏得率(%)=干膏量/药材总量×100%。结果见表2，方差分析见表3。
2.2.2 柚皮苷含量测定
2.2.2.1 对照品溶液的制备 柚皮苷对照品精密称定2.01 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度得对照品溶液，其质量分数为201 μg・mL-1。
2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取1.6 g各提取方法所得的干浸膏，至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，密塞，超声10 min，静置10 min，并用甲醇定容至刻度。取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得续滤液作为供试品溶液备用。按处方比例及工艺制备不含骨碎补的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。
2.2.2.3 色谱条件 色谱柱Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相乙腈∶质量分数为0.4%的醋酸水= 19∶81;检测波长为283 nm;流速为1.0 mL・min-1，柱温为25 ℃;进样量为10 μL。
2.2.2.4 专属性考察 分别取2.2.2.1项下对照品溶液、2.2.2.2项下供试品液、阴性样品溶液，按上述HPLC分析条件测定，进样10 μL，结果表明，阴性样品溶液在柚皮苷峰位处无干扰，证明此法具有良好的专属性，见图1。
2.2.2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，质量分数分别为20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg・mL-1，按2.2.2.3项下条件进行测定，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，药物质量分数(C)为横坐标，进行线性回归，得柚皮苷回归方程为Y = 18 722 C-33 165(r = 0.999 9)，结果表明，柚皮苷质量分数在20.1～100.5 μg・mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。