高效液相色谱法测定苯扎贝特中的有关物质
摘 要：目的：对采用高效液相色谱法测定苯扎贝特当中的有关物质进行研究。方法：USKH071233C18：甲醇=4：6，流动相是磷酸二氢钾溶液，在检测的过程中，检测波长度为228nm，流速为1.0ml/min。结果苯扎贝特和五种主要的杂质都能取得良好的分离效果。结论：这种测定方法在应用的过程中能够体现出非常高的灵敏度和准确度，因此这种方法也可以应用在苯扎贝特有关物质含量的控制和测定当中。
关键词：苯扎贝特;系统适用性;有关物质
苯扎贝特是一种氯贝丁酸衍生物类的血脂调节类药物，在降血脂方面，其具备两种机制：首先是提高脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，这样也就使得低浓度的蛋白可以更加迅速的完成分解和代谢功能，从而使得上血甘油三脂的水平出现了非常明显的下降现象，从而也就使得基底密度的脂蛋白分泌量出现非常显著的减少现象，从而也就十分有效的降低了血低密度蛋白酶的量以及胆固醇的水平，在生产的过程中可能会出现一定的杂质，所以我们需要对其进行测定和分离，保证药物的药效。
一、仪器与试药
高效液相色谱仪系统：Agilent 1200检测器： Agilent 1200分离单元(四元泵、自动进样器、柱温箱);软件：安捷伦工作站;HP1020打印机。苯扎贝特EP标准品(lot：n0.1.a);甲醇(色谱纯04020-3，OCEANPAK ALEXATIVE CHEMLCAL);杂质A(lot：20061116，含量：99.8%中间体);杂质B(lot：T20060919，含量：100%国药集团化学试剂有限公司)，杂质C(lot：20061101，含量：99.6%自制)，杂质D(lot：20061101，含量：99.5%自制)，杂质E(lot：20070226，含量：99.5%自制)。
二、方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱： USKH071233C18(5um)0.125m×4mm。流速为1ml/min;检测波长为228nm。流动相：磷酸二氢钾溶液(2.72g/L，用磷酸调节PH2.3)：甲醇=4：6;进样量：20ul。
2.2 溶液制备
供试样品溶液：精确称取该品50mg，将其放置在容积为100ml的容量瓶当中，加入一定的流动相，采用超声波的方式使其溶解，将其静置直至其温度达到室温的水平。用流动相稀释到刻度的位置，将其混合均匀之后配制成0.5mg/ml的溶液。对照品溶液(a)精确量取供试品溶液10ml，加入流动相之后将其放入到容积为100ml的容量瓶当中，稀释到刻度的位置。再吸出5.0ml的上述溶液，加入适量的流动相，使其稀释到100ml。对照品溶液(b)：精确吸取对照品溶液(a)5.0ml，加入适量的流动相将其稀释到50.0ml即完成了对照品溶液(b)的配制。对照品溶液(c)：精确量取1ml的试验溶液和1ml浓度为1mol/L的盐酸溶液，和其充分的混合之后，在电热板上进行加热处理，直至蒸干。残渣使用流动相进行溶解处理，同时坏要将其稀释到20ml。
2.3 系统适应性试验
系统在运行的过程中达到相对平衡的状态之后，根据上述的'色谱条件精确量取对照溶液(a)20μl进行进样处理，对系统的灵敏度进行适当的调整，从而使得主峰的高度占到记录仪最大刻度的5成以上，连续进样5次，从而得到苯扎贝特峰计算的理论塔板数N=3916，峰面积RSD=1.0%，在2.0%以内。之后再精确的量取对照溶液(c)20μl进行进样处理，对这一过程中的色谱图进行全面的记录。在记录对照液(c)的色谱图过程中，两个主峰分离度达到了5.0以上。在对对照液(b)的色谱图进行记录的过程中发现色谱图当中的信噪至少是5。
空白测试：取适量的流动相进行进样处理，作为容积空白，这也充分的标明流动相对杂质的测定并不会产生负面的影响，样品测定过程中的溶剂峰可以忽略不计。
2.4 方法的专属性
2.4.1 结构确认(委托中国药科大学检测)：经红外光谱，核磁共振，质谱等结构解析确证各杂质的结构。
2.4.2 单个杂质的定性。依次取“2.7线性关系项下杂质标准贮备液”(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F)1.0mL，各至一个50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。每个溶液分别进样，记录各组分的保留时间，用保留时间对每个杂质进行定性。
2.5 破坏性试验
精密称取样品细粉10mg，将其放入到容积为10ml的容量瓶当中，将其平均分成5份，对其分别进行高温、光照、强酸、强碱和强氧化等破坏性试验，使用流动相将其稀释成浓度为1mg/ml的溶液，分别对其进行进样测定。测定之后发现所有破坏条件下降解产物和主成分峰分离的效果非常好。
2.6 精密度和重复性
在重复性和中间精密度测试项之下，标准溶液连续进行6次进样处理，各组分的峰面积RSD都在2.0%之内，重复性和中间的密度并没有非常明显的差异。
2.7 线性关系考察
杂质的标准储备液：分别严格按照要求去称取以下标准品：分别精密称取以下标准品：杂质A～E和苯扎贝特10.0mg，各至一个25ml容量瓶中，各加入流动相溶解并稀释至刻度，混合均匀，得到每个杂质的标准贮备液。每个杂质的浓度均约为400ug/ml。杂质标准储备溶液(a)分别量取杂质标准储备溶液5.0ml，将其放入到容积为100.0ml的容量瓶当中，使用适量的流动相将其稀释到刻度的位置，同时还要进行摇匀处理。各杂质和苯扎贝特的浓度为20μg/ml。
杂质线性标准溶液：分别取杂质标准贮备溶液(a)0.5ml，1.0ml，2.5ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，8.0ml各至一个50.0ml容量瓶，用流动相稀释至刻度，混合均匀，得到No.1～No.7线性标准溶液。各杂质及苯扎贝特的浓度范围为0.2～3.2ug/ml，相当于杂质及苯扎贝特含量0.02%～0.32%。测定：分别取No.1～No.7线性标准溶液，分别进样，每个浓度连续进3次，记录色谱图。以各组分峰面积平均值对其浓度(ug/ml)，使用origin5.0软件进行线性回归，得到各组分的标准曲线。在线性测试项下各组分峰面积与溶液的浓度均成线性关系，且相关系数r均大于0.999，该方法的线性关系良好。
2.8 回收率
以中间精密度项下5号现象标准溶液为主要标准，按照其特定的公式来对回收率进行统计，同时还要计算出平均的回收率。在回收率测试项当中，各个组分在不同浓度下不同杂质的平均回收率都处在了85.0%-115.0%之间。
2.9 杂质检测限、定量限的测定
在色谱系统下进样，记录色谱图。当待测组分的信噪比为2～3倍时，对应的浓度为该组分的最小检测浓度(Cm1);当待测组分的信噪比为10～20倍时，对应的浓度为该组分的最小定量浓度(Cm2)。所有测定杂质的检测限结果范围从0.001%～0.002%，定量限结果范围从0.002%～0.02%;其它未知杂质的检测限和定量限以苯扎贝特进行评价，依次为0.001%和0.002%。
2.10 样品的稳定性
取0.5mg・mL-1样品溶液分别于0、5、10、20、30和50h进样测定。结果表明，样品放置室温下，2天稳定性良好。
2.11 样品有关物质测定。空白测试：取流动相20μL进样，记录色谱图。在样品的测试中忽略溶剂峰。取样品溶液20μL进样，记录色谱图。样品杂质含量测定结果符合规定。
三、讨论
在本实验当中，研究人员采用的是高效液相色谱法对相关物质进行测定，这种方法能够有效的对苯扎贝特的主成分，中间体和分离产物进行分离处理，这种方法操作便捷，同时还具备非常强的专属性。这种方法在很广泛的范围之内都能体现出较好的检测灵敏度，同时还能对中间体和其他杂质进行全面的检查，具有非常强的优越性。
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